Sanger测序技术及其检测项目详解
一、Sanger测序技术简介 Sanger测序（链终止法测序）是一种经典的DNA测序技术，由Frederick Sanger于1977年发明。其核心原理是通过合成与模板链互补的DNA链，利用双脱氧核苷酸（ddNTPs）随机终止链延伸，生成不同长度的DNA片段，再通过电泳分离和荧光检测确定碱基序列。尽管高通量测序技术（NGS）已广泛应用，Sanger测序因其高准确性（>99.99%）和单次反应长读长（约800-1000 bp）的优势，仍在特定检测项目中占据不可替代的地位。
二、Sanger测序的核心检测项目 Sanger测序主要应用于对目标DNA片段的高精度分析，尤其在以下领域中发挥关键作用：
1. 临床医学与遗传病诊断
- 点突变与单核苷酸多态性（SNP）检测 用于检测与遗传病相关的基因突变（如β-地中海贫血、囊性纤维化、亨廷顿病等），明确致病位点。
- 肿瘤基因突变验证 对NGS或PCR筛查出的肿瘤驱动基因突变（如EGFR、KRAS、BRAF等）进行验证，指导靶向治疗。
- 线粒体DNA分析 检测线粒体疾病相关突变（如Leber遗传性视神经病变）。
- HLA分型 辅助器官移植配型，精准匹配供体与受体的HLA基因型。
2. 法医学与个体鉴定
- 短串联重复序列（STR）分析 通过分析个体特异的STR位点，用于亲子鉴定、犯罪现场DNA比对等。
- 线粒体DNA测序 适用于陈旧或降解样本的个体识别（如骨骼、毛发）。
3. 农业与生物科研
- 转基因生物（GMO）检测 验证外源基因插入位点及序列完整性。
- 物种分类与进化研究 通过特定基因（如16S rRNA、COI基因）测序分析物种亲缘关系。
- 基因编辑验证 对CRISPR/Cas9等基因编辑结果进行靶向区域的精准序列确认。
4. 微生物学与传染病检测
- 病原体耐药基因分析 检测结核杆菌、HIV等病原体的耐药突变（如结核杆菌的rpoB基因突变）。
- 病毒分型与溯源 对HPV、HBV、HCV等病毒进行基因分型，指导治疗和流行病学追踪。
5. 药物研发与伴随诊断
- 药物代谢相关基因检测 分析CYP450家族基因多态性，预测药物代谢差异。
- 临床试验样本验证 确保实验组与对照组的基因背景一致性。
三、Sanger测序的流程与优势
- 流程概述
- DNA提取 → PCR扩增目标区域 → 纯化产物 → 测序反应（加入ddNTPs） → 毛细管电泳 → 数据分析。
- 核心优势
- 高准确性：适用于临床诊断等对结果可靠性要求高的场景。
- 灵活性：针对特定片段快速检测，成本低于NGS（小样本量时）。
- 标准化成熟：兼容临床实验室的自动化流程。
四、Sanger测序的局限性及适用场景
- 局限性：通量低、成本效益比在大样本量时低于NGS。
- 适用场景：
- 需验证NGS或芯片检测结果的可疑位点。
- 样本量少、目标区域明确（如单基因病诊断）。
- 法规要求金标准方法的检测场景（如部分伴随诊断）。
五、未来展望 尽管高通量测序技术快速发展，Sanger测序仍将在靶向验证、临床诊断和法医学等领域持续发挥作用。其与NGS的互补性（如“NGS初筛+Sanger验证”模式）将进一步推动精准医学的发展。
结论 Sanger测序凭借其无可替代的准确性和可靠性，依然是基因检测领域的“金标准”。在遗传病诊断、肿瘤个体化治疗、法医鉴定等关键项目中，它提供了不可动摇的技术支持。