膜通透性增加检测

发布时间：2025-07-03 12:57:50 阅读量：1 作者：生物检测中心

膜通透性增加检测：原理、方法与应用

细胞膜作为生命单元的关键屏障，其完整性对维持细胞内稳态至关重要。当物理、化学或生物因素损伤膜结构，导致其选择性通透屏障功能丧失，即发生膜通透性增加。这不仅标志细胞损伤程度，与细胞死亡（如坏死）密切相关，更在病原体感染、药物开发、毒理学评价及疾病机制研究中扮演核心角色。准确检测膜通透性变化是生物医学研究的基石技术之一。

一、核心检测原理

膜通透性增加的共性特征是细胞膜屏障功能部分或完全丧失：

  1. 屏障失效： 正常情况下无法自由穿越膜的大分子物质（染料、酶、荧光探针）进入胞内或胞内物质外泄。
  2. 离子失衡： 膜电位改变，胞内离子浓度稳态打破。
  3. 膜结构改变： 可能伴随膜脂质流动性变化或蛋白质构象异常。
 

检测方法即基于这些现象进行设计。

二、常用检测方法详解

1. 染料摄取/排除法

  • 原理： 利用正常完整细胞膜阻挡特定染料进入，而膜受损细胞则允许染料摄入或积累的特性。
  • 代表性染料：
    • 台盼蓝 (Trypan Blue)：
      • 机制： 活细胞排斥台盼蓝不着色（透明）；死细胞/膜严重受损细胞摄取台盼蓝呈蓝色。
      • 操作： 细胞悬液与等体积台盼蓝溶液混合，显微镜下观察计数着色（死）与未着色（活）细胞。手动或自动化细胞计数仪进行。
      • 优点： 操作简便、快速、成本低，广泛应用于细胞活力/毒性初筛。
      • 局限： 主观性较强；灵敏度受限，主要反映晚期或严重膜损伤；仅适用于悬浮细胞或易消化为悬浮的贴壁细胞；无法区分膜损伤程度。
    • 碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) / 7-AAD：
      • 机制： 不能透过完整细胞膜。一旦膜通透性增加，PI进入细胞并与核酸（DNA/RNA）结合，发出红色荧光。
      • 操作： 通常在流式细胞术中使用。细胞经处理后，加入PI孵育，流式细胞仪检测PI阳性细胞群（膜受损细胞）。常与Annexin V联用区分凋亡与坏死。
      • 优点： 可定量、高通量、灵敏度较高（优于台盼蓝），区分不同损伤程度；适用于悬浮和贴壁细胞（制成悬液）。
      • 局限： 依赖仪器（流式细胞仪）；主要反映后期损伤（核酸可及性）；PI本身有微弱毒性。
    • 二乙酸荧光素 (FDA) / 碘化丙啶 (PI) 双染：
      • 机制：
        • FDA本身无荧光，可自由进入活细胞，胞内酯酶将其水解为带负电荷的绿色荧光物质荧光素，积累在膜完整的活细胞内。
        • PI无法进入活细胞，但可进入膜通透性增加的细胞结合核酸发红色荧光。
      • 操作： 细胞同时或先后经FDA和PI孵育，荧光显微镜或流式细胞术观察。镜下可见：活细胞（绿色）、死细胞（红色）、濒死/早期凋亡细胞（双染，橙黄色）。
      • 优点： 可同时区分活细胞、死细胞及处于膜通透性变化早期的细胞；直观（显微镜）。
      • 局限： FDA水解依赖胞内酶活性，某些病理状态酶活性下降可能造成假阴性；操作相对复杂。
 

2. 胞浆酶/标志物释放法

  • 原理： 膜通透性增加导致正常情况下存在于胞浆内的酶或可溶性标志物泄漏到细胞外培养液中，通过检测上清液中该物质活性或浓度升高来判断膜损伤。
  • 代表性标志物：
    • 乳酸脱氢酶 (LDH)：
      • 机制： LDH广泛存在于胞浆中，膜完整时极少渗出。膜损伤后大量释放至培养上清。
      • 操作： 收集细胞培养上清液，加入含有乳酸、NAD⁺、INT（四氮唑盐）等的LDH检测试剂。LDH催化乳酸→丙酮酸，同时NAD⁺→NADH；NADH进一步还原INT为红色甲臜，其光密度(OD490nm左右)与LDH活性（即细胞损伤程度）成正比。分光光度计测量。
      • 优点： 可定量、标准化程度高、灵敏度较好（尤其对早期轻微损伤）；适用于多种细胞类型（包括贴壁细胞）；有商品化试剂盒可用。
      • 局限： 需设置最大释放对照（如Triton X-100裂解细胞）和自发释放对照（正常细胞组）；血清中可能含少量LDH，需注意背景扣除；不能区分不同类型细胞死亡；高浓度化合物或严重溶血可能干扰比色反应。
    • 其他酶： 如醛缩酶、天冬氨酸氨基转移酶等也可用于特定细胞类型（如肝细胞）。
 

3. 荧光探针摄取法

  • 原理： 利用本身无荧光或荧光特性改变的分子，进入膜通透性增加的细胞后发生特定反应（如被酶激活、结合胞内组分改变荧光）而产生可检测信号。
  • 代表性探针：
    • 钙黄绿素 AM (Calcein AM)：
      • 机制： AM酯具有膜通透性（亲脂性），可进入几乎所有活细胞。胞内酯酶水解AM酯基团，产生带负电荷的亲水性钙黄绿素，滞留于膜完整的活细胞内发出强绿色荧光。膜通透性增加时，钙黄绿素会快速泄漏出细胞，导致细胞内荧光强度下降。
      • 操作： 细胞加载Calcein AM孵育一定时间，洗去多余探针。荧光显微镜、荧光酶标仪或流式细胞术检测细胞内绿色荧光强度或阳性细胞比例。荧光下降表示膜通透性增加（细胞死亡或损伤）。
      • 优点： 灵敏度高，可定量活细胞比例；适用于实时或终点检测。
      • 局限： 需注意加载条件优化（浓度、时间、温度）；依赖于胞内酯酶活性；某些细胞类型（如神经元、干细胞）可能负载效率低。
    • SYTOX® 系列染料 (如 SYTOX Green/Blue)：
      • 机制： 高亲和力核酸染料，本身无膜通透性，不能进入活细胞。膜通透性增加时进入细胞结合核酸，荧光信号显著增强（比PI灵敏度更高）。
      • 操作： 直接将SYTOX染料加入培养液中孵育，无需洗脱。实时或在终点用荧光显微镜、酶标仪或流式细胞仪检测荧光强度增强。
      • 优点： 操作极其简便（无需洗涤）；灵敏度非常高（可检测早期膜损伤）；适用于实时监测动力学过程；对活细胞无毒。
      • 局限： 需专用探针；成本相对较高。
 

4. 电生理方法 (膜片钳技术)

  • 原理： 直接测量细胞膜的电阻（膜电导）或离子通道电流。膜通透性增加通常表现为膜电阻下降或非特异性漏电流增加。
  • 操作： 使用玻璃微电极与细胞膜形成高阻封接（吉欧姆封接），通过放大器记录全细胞模式下的膜电流或电阻。
  • 优点： 最直接、灵敏测量膜通透性或离子通道状态的方法；可实时、高精度研究通透性变化的动力学和机制（如特定离子通道参与）。
  • 局限： 技术难度高，操作复杂且耗时；需要专业仪器和训练有素的人员；通常一次只能记录一个或少数几个细胞；主要适用于研究深入机制的特定实验，不适合高通量筛选。
 

5. 放射性同位素标记物示踪法

  • 原理： 利用放射性标记的小分子（如³H-水、¹⁴C-尿素、⁸⁶Rb⁺）或不易进入正常细胞的分子（如³H-蔗糖）。膜通透性增加时，标记物在胞内外的分布发生改变。
  • 操作： 将细胞与含放射性标记物的溶液共同孵育，特定时间后迅速分离细胞（如离心、滤膜过滤）或移除培养基，洗涤去除未被摄取的标记物。测量细胞内的放射性计数（液体闪烁计数仪）。
  • 优点： 灵敏度极高，可用于检测非常微小的通透性变化；可定量研究特定物质转运速率。
  • 局限： 操作复杂（需快速分离洗涤防止假摄取）；涉及放射性物质，需特殊防护、操作许可和废物处理；成本高，应用逐渐被非放射性方法替代。
 

三、实验设计与关键考量

  1. 对照设置 (至关重要)：

    • 阴性对照： 健康、未处理的细胞样本。提供背景值和基准线（如自发释放、正常荧光水平）。
    • 阳性对照： 使用已知能可靠造成膜损伤的试剂处理细胞（如1% Triton X-100裂解细胞用于LDH检测；70%乙醇固定用于PI染色）。用于验证实验体系工作正常，并确定最大损伤信号值（用于计算百分比损伤）。
    • 空白对照： 不含细胞的试剂或培养基对照（扣除背景干扰）。

  2. 细胞状态与密度： 使用状态良好、对数生长期的细胞；接种密度需均一，过高或过低均影响结果可靠性（如细胞接触抑制或死亡增加）。

  3. 处理时间与浓度： 根据研究目的（急性损伤或慢性效应）和所用方法特点优化处理时间点和化合物浓度梯度。动力学研究需设置多个时间点取样。

  4. 检测时间窗口： 某些方法（如LDH释放）需要足够时间让酶释放积累；而荧光染料（如PI）反应较快。需了解所选方法的适宜检测时间。

  5. 方法组合应用： 单一方法可能不足以全面评估膜通透性变化及其意义（如区分坏死与晚期凋亡）。常需结合多种正交方法（如LDH+PI双染/流式）以及检测其他细胞死亡标志物（如Caspase活性测凋亡）进行综合判断。

  6. 干扰因素排除：

    • 化合物干扰： 被测化合物本身可能具有荧光、淬灭荧光或影响检测试剂（如抑制LDH活性）。需设置仅含被测化合物的对照孔评估干扰。
    • 血清干扰： 培养基中的血清可能含微量酶（如LDH），需在空白和对照中扣除。高浓度血清也可能影响染料结合。
    • 细胞状态干扰： 增殖活跃或代谢异常的细胞其背景酶活性或染料代谢可能不同。
    • 洗涤步骤： 不当洗涤可能造成细胞丢失或损伤，影响准确性。优化洗涤次数和缓冲液成分。
 

四、应用领域

  1. 细胞毒性评价： 药物安全性评价（新药筛选、环境污染物）、纳米材料生物相容性研究、化妆品原料刺激性评估等，LDH法和PI流式最为常用。
  2. 细胞死亡机制研究： 区分坏死（膜通透性早期显著增高）、凋亡（早期膜完整，晚期继发性坏死时通透性增高）、焦亡（伴随膜孔形成导致的通透性快速增加）。
  3. 病原体-宿主互作： 研究细菌毒素（如穿孔毒素）、病毒（如诱导细胞融合或溶解）对宿主细胞膜的直接损伤作用。
  4. 缺血/再灌注损伤： 评估心肌、脑、肝等器官在缺血缺氧及恢复血流后的细胞膜损伤程度。
  5. 膜通道与转运体功能研究： 膜片钳和放射性示踪法用于研究特定离子通道或转运体功能异常导致的膜通透性改变。
  6. 物理因素损伤研究： 冻融、辐射、机械力（剪切力）等对细胞膜完整性的影响。
 

五、方法选择指南

  • 高通量初筛/细胞活力毒性： LDH法、台盼蓝计数、Calcein AM/荧光酶标仪法。
  • 区分活/死细胞比例及早期损伤： FDA/PI双染、SYTOX染色、PI流式。
  • 实时监测膜通透性动力学： SYTOX染色（实时荧光读数）、膜片钳（高灵敏度动力学）。
  • 检测极微小通透性变化/特异物质转运： 放射性同位素示踪法。
  • 深入研究膜通透性机制（离子通道）： 膜片钳技术。
  • 区分细胞死亡模式： 必须组合多种方法（如Annexin V-FITC/PI流式 + Caspase活性检测 + LDH释放）。
 

六、结论

膜通透性增加是细胞损伤与死亡的重要指标，其检测技术多样且互补。选择合适的方法需综合考虑研究目的（定性/定量？机制/筛查？）、所需灵敏度、通量、成本、设备条件以及对细胞状态的干扰。严谨的实验设计（特别是对照设置）和正确的结果解读（结合其他生物学指标）是获得可靠结论的根本。从经典的染料排斥法到高灵敏的SYTOX探针，从定量的LDH释放到直接的膜片钳记录，这些技术共同构成了评价细胞膜完整性的工具箱，在基础生命科学研究和应用生物医学领域发挥着不可替代的作用。深入理解每种方法的原理、优势和局限性，是优化实验设计、准确评估细胞状态的关键所在。