振荡烧瓶法抗菌性能检测技术指南
摘要： 振荡烧瓶法是一种广泛应用于评价液体或可溶出性固体材料抗菌活性的标准检测方法。其核心在于通过物理振荡，模拟材料在实际使用中可能经历的动态环境（如衣物摩擦、液体搅拌），促进抗菌成分的释放以及与测试微生物的充分接触，从而更真实地反映材料的抗菌效能。本指南详细阐述了该方法的原理、操作步骤、结果计算及关键注意事项。
一、 方法原理
该方法基于以下设计理念：
- 动态接触模拟： 将待测抗菌材料样品（或含有其溶出成分的液体）与特定浓度（通常为 1.0×10⁵~1.0×10⁶ CFU/mL）的微生物菌悬液共同置于含有中和剂的缓冲液（如磷酸盐缓冲液 PBS）中。
- 机械振荡促进作用： 将装有混合液的锥形烧瓶置于恒温恒速的振荡器上（常见频率为 150 rpm），在规定时间（通常为 0小时接触后立即取样作为对照，以及作用1小时、6小时、18小时或24小时等）内进行振荡培养。
- 充分混合与作用： 振荡运动确保了：
- 抗菌材料（或其溶出成分）在体系中均匀分布。
- 微生物与抗菌成分之间保持持续、充分的物理接触。
- 消除静态培养可能存在的局部浓度不均匀或扩散限制问题。
- 杀菌/抑菌效果评估： 在设定的作用时间点，立即从烧瓶中取样，用含有中和剂的稀释液进行梯度稀释。将稀释液接种于固体琼脂培养基上，经适宜温度和时间培养后，计数存活菌落形成单位（CFU）。
- 结果计算： 通过比较作用一定时间后（t）的活菌数与零接触时间（0小时）的活菌数（代表初始接种量），计算抗菌活性值，通常表示为抗菌率（R）或杀菌率。计算公式如下：
抗菌率 R (%) = [(A - B) / A] × 100%A：零接触时间对照组（通常为不含抗菌材料的空白样或在PBS中处理的样品）的平均活菌数（CFU/mL）。B：抗菌样品在作用时间 t 后的平均活菌数（CFU/mL）。
二、 适用范围
振荡烧瓶法尤其适用于评估：
- 可溶出性抗菌材料： 纺织品（经抗菌剂后整理）、纤维、泡沫、海绵、水处理剂、液体消毒剂、抗菌洗涤剂等，其抗菌效果主要依赖于材料表面释放的活性成分。
- 液体抗菌产品： 可直接添加至测试体系中进行评价。
- 模拟动态环境： 特别适合评估在动态水流、机械摩擦或搅拌条件下使用的材料的抗菌性能（如洗衣机中的衣物、水过滤材料、循环液体系统组件）。
- 多种微生物： 可适用于细菌（如金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、大肠杆菌 Escherichia coli、铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa）、酵母菌（如白色念珠菌 Candida albicans）和部分霉菌。
三、 标准操作步骤概述
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准备阶段：
- 试剂与培养基： 制备无菌磷酸盐缓冲液（PBS）、营养肉汤、琼脂平板、含适宜中和剂的稀释液（根据抗菌剂特性选择，如卵磷脂、吐温80、硫代硫酸钠、组氨酸等，用于终止抗菌作用）。
- 菌种活化与培养： 将标准测试菌株接种于适宜的斜面或平板培养基上，在指定温度（如细菌37°C，酵母霉菌25-28°C）下培养规定时间（通常18-24小时）。
- 菌悬液制备： 用PBS将培养好的菌落洗脱下来，通过离心洗涤调整浓度，最后用PBS稀释至目标接种浓度（通常 1.0×10⁵~1.0×10⁶ CFU/mL）。可使用平板计数法或浊度法标定。
- 样品处理： 固体样品按标准要求裁剪成规定尺寸（如 0.5 cm × 0.5 cm）或重量（常用0.75 g±0.05 g），确保总表面积一致。液体样品可直接使用或稀释至测试浓度。样品需预先灭菌。
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测试阶段：
- 烧瓶准备： 在无菌锥形烧瓶（如250mL）中，加入规定体积（如70mL）的PBS。
- 加入样品与中和剂（若适用）： 将规定量的抗菌样品（或等量空白对照样品）放入烧瓶。如果中和剂直接加在测试体系中，此时加入规定量。
- 接种与计时： 向每个烧瓶中加入规定体积（如5mL）的已标定菌悬液，迅速混匀。此时间点记为“0小时接触时间”。
- 0小时取样（对照）： 立即 从含有空白对照样品（或仅PBS）的烧瓶和含抗菌样品的烧瓶中（可选，有时仅取抗菌样品作用前值用于计算回收率）取样1mL（或规定量），加入含9mL（或规定量）中和剂稀释液的试管中（达到10⁻¹稀释度），充分混匀。此样本用于测定初始活菌数
A。 - 振荡培养： 将所有烧瓶（包括0小时取样后的烧瓶）置于已设定好温度（如24±1°C或37±1°C）和振荡频率（如150±3 rpm）的恒温振荡器中。
- 作用一定时间后取样： 在设定的作用时间点（如1小时、6小时、24小时），立即从每个振荡中的烧瓶取样1mL（或规定量），加入含9mL（或规定量）中和剂稀释液的试管中（10⁻¹），充分混匀。取样动作必须快速准确。
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活菌计数：
- 梯度稀释： 根据预期杀菌效果，对10⁻¹稀释液进行进一步的10倍梯度稀释（如10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴...）。通常每个稀释度做2-3个平行。
- 倾注平板或涂布： 从适宜的稀释度（预期产生30-300个菌落）取1mL稀释液，加入到无菌平皿中，倾注约15mL融化并冷却至45-50°C的琼脂培养基，迅速混匀待凝。或取0.1mL稀释液涂布于已凝固的琼脂平板表面。
- 培养： 将平板倒置放入恒温培养箱中，在适宜温度和时间（细菌通常37°C培养24-48小时；酵母霉菌25-28°C培养48-72小时）下培养。
- 菌落计数： 选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数。
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结果计算与报告：
- 计算每组样品（抗菌样、空白对照）在每个时间点的平均活菌浓度（CFU/mL）。
- 使用前述公式计算抗菌样品在每个作用时间点的抗菌率
R (%)。 - 报告应包括：测试样品描述、对照描述、测试菌株、菌液浓度、中和剂、振荡参数（频率、温度）、作用时间、各平行样及平均活菌数、计算得到的抗菌率
R值。
四、 关键注意事项
- 无菌操作： 整个过程必须在无菌条件下进行，防止外源性污染。
- 菌液浓度准确性： 接种菌液浓度直接影响结果可靠性，必须精确标定。
- 中和剂验证： 至关重要！ 必须确保所选用的中和剂能有效、及时地中和抗菌剂的残留活性，且本身对微生物无明显毒性或促生长作用。需通过专门的验证试验确认。
- 振荡参数一致性： 振荡频率、振幅（或轨道直径）和温度必须严格控制并保持一致，这些因素直接影响接触效率和微生物活力。
- 取样时机与速度： “0小时”取样必须立即完成。作用时间点的取样也要迅速准确，并立即加入中和剂稀释液中终止反应。
- 样品代表性： 固体样品需均匀且有代表性，确保测试表面积或重量一致。液体样品需混匀。
- 稀释与计数： 选择合适的稀释梯度至关重要，确保计数平板上的菌落在有效范围内（30-300 CFU/平板）。注意区分菌落与杂质。
- 对照设置： 必须设立有效的空白对照（不加抗菌材料，仅PBS和菌液）或载体对照（不加抗菌剂的同质材料）。有时还需设置中和剂毒性对照、样品无菌性对照等。
- 结果解读： 抗菌率
R值越高，表明抗菌效果越强。一般认为R ≥ 90%或R ≥ 99%具有显著的抗菌效果，具体标准需参照相应产品标准或协议。
五、 方法特点与局限性
- 优点：
- 能有效模拟材料在实际动态环境（如洗涤、摩擦、液体流动）中的抗菌作用。
- 操作相对简单，通量较高。
- 适用于多种材料和微生物。
- 结果量化明确（抗菌率）。
- 局限性：
- 主要评估材料的溶出性抗菌效果，对非溶出性（接触性）抗菌材料评价效果有限或不适用。
- 测试结果受振荡参数（频率、振幅）影响显著。
- 对高吸附性材料可能导致结果偏差（菌体或抗菌剂吸附在样品上）。
- 对于作用非常迅速的抗菌剂，“0小时”取样的准确性挑战较大。
- 需要有效的中和剂。
结论
振荡烧瓶法是一种标准化、应用广泛且能较好模拟动态使用环境的抗菌性能评价方法，特别适用于依赖溶出性抗菌成分的材料和产品。其结果的准确性和可靠性高度依赖于对关键操作细节的严格把控，尤其是菌液浓度标定、中和剂的选择与验证、振荡参数的精确控制以及规范的无菌操作。正确理解和应用该方法，可为抗菌材料的研发、质量控制及功效宣称提供重要的科学依据。进行测试时，应严格遵循相关的国家标准（如 GB/T 20944.3《纺织品 抗菌性能的评价 第3部分：振荡法》）或国际标准（如 ISO 20743《纺织品-抗菌活性的测定》）的具体要求。