扫描电子显微镜在细菌形貌观察中的应用：原理、技术与解析
扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope, SEM）凭借其出色的景深与高分辨率成像能力，现已成为直观揭示细菌表面精细三维结构的关键工具，在微生物学、环境科学、医学及材料科学等诸多领域具有不可替代的地位。
一、SEM成像的核心原理
SEM成像基于高能电子束与样品表面的相互作用：
- 电子源与聚焦： 热场发射或肖特基发射电子枪产生高亮度、高相干性的电子束，经电磁透镜系统精确聚焦成纳米尺度的探针。
- 样品扫描与相互作用： 聚焦电子束在样品表面进行光栅式逐点扫描。入射电子与样品原子相互作用，激发出多种信号：
- 二次电子（Secondary Electrons, SE）： 能量较低（<50 eV），主要来自样品表层（几纳米深度）。其产额对样品表面形貌极为敏感，是生成高分辨率、高景深立体图像的主要信号源，能清晰呈现细菌表面的凹凸、沟壑、纹理及附属结构。
- 背散射电子（Backscattered Electrons, BSE）： 能量较高，源于样品较深处（几百纳米）。其产额与样品原子序数相关，可用于成分衬度成像，区分细菌与基底或其他具有不同原子序数的物质。
- 信号探测与图像构建： 专用的二次电子探测器（如 Everhart-Thornley 探测器）或背散射电子探测器捕获相应信号。信号强度被转化为电压变化，经放大后同步调制显示器上对应像素点的亮度，最终构建出反映样品表面形貌或成分分布的二维图像。现代高分辨率场发射SEM的分辨率可达1纳米以下（在最佳条件下），足以清晰分辨细菌表面的精细形态特征。
二、细菌SEM观察的关键样品制备技术
细菌样品（多为含水的生物软组织）在进入高真空的SEM样品室前必须经过严格处理，以满足成像要求：
- 化学固定：
- 目的： 瞬间终止代谢活动，稳定细胞结构（蛋白质、脂质、核酸等），最大限度地保持接近生活状态的原始形貌。
- 常用试剂： 戊二醛（常用浓度2.5-4%）进行初级交联固定；随后用锇酸（OsO₄，常用浓度1-2%）进行后固定，增强膜结构对比度并提高导电性。
- 要点： 固定需在低温（如4°C）下进行，固定液渗透速度、浓度、pH值（常用缓冲液如磷酸盐缓冲液PBS或二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.2-7.4）及时间均需优化控制。
- 缓冲液清洗： 彻底去除残留的固定液，避免结晶污染。
- 梯度脱水：
- 目的： 逐步用有机溶剂（常用乙醇或丙酮）替代样品中的水分，为后续干燥步骤做准备。
- 流程： 通常采用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%（2-3次）的梯度乙醇/丙酮溶液，每步浸泡10-20分钟。此步骤需轻柔操作，避免渗透压剧烈变化损伤细胞形态。
- 干燥处理（关键步骤）：
- 临界点干燥（Critical Point Drying, CPD）： 这是观察细菌自然形态的首选方法。
- 原理： 利用临界点（如液态CO₂在31.1°C，73 atm下气-液界面消失）时表面张力为零的特性，避免因气-液界面张力造成的样品塌陷。
- 流程： 样品脱水后，浸入中间液（常用乙酸异戊酯或丙酮替代乙醇）。装入CPD仪样品室，用液态CO₂置换中间液。升温加压至CO₂超临界状态，然后缓慢释放气体至常压。
- 优势： 能最大程度保留细菌精细的三维结构，尤其是纤弱的菌毛、鞭毛等。
- 空气干燥： 简单快速（直接暴露于空气中），但表面张力极大，极易造成样品严重收缩、变形、断裂，仅适用于对形态要求不高的初步观察。
- 冷冻干燥： 样品快速冷冻后，在真空下使冰升华。可减少化学损伤，但冰晶形成风险高，操作复杂，在细菌常规形貌观察中应用相对较少。
- 临界点干燥（Critical Point Drying, CPD）： 这是观察细菌自然形态的首选方法。
- 样品基底粘附： 将干燥后的样品牢固粘附在导电样品台（通常为铝质或铜质）上，常用导电胶带或银胶。粘附需稳固，避免观察时样品漂移。
- 导电处理：
- 目的： 生物样品导电性差，在电子束轰击下易积累电荷（荷电效应），导致图像畸变、漂移、亮点及条纹伪影。
- 方法：
- 金属镀膜（主流方法）： 在高真空喷镀仪中，在样品表面溅射或蒸发沉积一层极薄的（几纳米到几十纳米）导电金属膜。常用金属：
- 金（Au）或金钯（Au/Pd）： 导电性好，二次电子产额高，成像效果好，是最常用选择。
- 铂（Pt）或铂钯（Pt/Pd）： 晶粒更细小，分辨率略高，常用于超高分辨率观察。
- 铬（Cr）： 粘附性好，膜层薄，适用于需要更高分辨率观察的情况。
- 低真空/环境SEM： 利用较高腔压下的气体分子电离中和电荷，可直接观察部分未镀膜的干燥生物样品，但分辨率通常低于高真空模式下的镀膜样品。
- 导电染色剂： 在固定或脱水阶段加入如单宁酸、锇酸等，增强样品整体导电性（效果有限，常作为镀膜辅助）。
- 金属镀膜（主流方法）： 在高真空喷镀仪中，在样品表面溅射或蒸发沉积一层极薄的（几纳米到几十纳米）导电金属膜。常用金属：
- 镀膜要点： 膜层必须均匀、连续、厚度适中。过薄无法有效消除荷电；过厚会掩盖样品表面细节。
三、SEM观察细菌形态的核心应用领域
- 菌种鉴定与分类辅助： 直观展示细菌形态（球菌、杆菌、螺旋菌）、大小、排列方式（单个、成对、链状、葡萄状）、有无荚膜、有无鞭毛（类型、数量、位置）、菌毛等附属结构，为传统生化鉴定和分子生物学方法提供重要的形态学依据。
- 生物膜结构与形成研究：
- 可视化生物膜从细菌粘附、微菌落形成到成熟三维结构（蘑菇状、塔状、网络状）的全过程。
- 揭示细胞外多聚物基质（EPS）的形态、分布及其包裹连接细菌细胞的状态。
- 研究不同环境条件（营养、剪切力、表面性质）对生物膜结构的影响。
- 细菌-宿主/材料相互作用：
- 致病机制： 观察病原菌在宿主细胞（如上皮细胞、巨噬细胞）表面的粘附、侵入（例如沙门氏菌的“侵袭”）形态变化。
- 免疫反应： 观察免疫细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）吞噬、杀伤细菌的过程。
- 生物材料相容性/抗菌材料评估： 清晰展示细菌在各种医疗器械、植入物材料（如导管、假体、牙科材料）表面的粘附数量、分布模式（单个分散还是聚集）、形态变化（如抗菌材料导致的细胞膜破裂、内容物泄露、塌陷等），评价材料表面的抗粘附或杀菌效能。
- 极端环境微生物研究： 观察生存在高温、高盐、强酸、强碱、高压等极端环境中的特殊细菌的表面形态适应特征。
- 抗菌药物作用机制研究： 直接观察抗生素、抗菌肽、噬菌体等作用于细菌后引起的细胞壁/膜损伤（穿孔、凹陷、破裂、溶解、球状体形成）、细胞内容物外溢、细胞裂解等形态学变化，揭示其杀菌或抑菌机制。
- 细菌纳米结构研究： 高分辨率SEM可观察细菌表面更精细的结构，如S层（规则蛋白晶格）、纳米线（用于电子传递）等。
四、结果分析与操作要点
- 图像解读：
- 结合样品制备过程（尤其是干燥方法）评估图像可靠性，识别可能的假象（如皱缩、断裂、表面物质沉积）。
- 区分细菌本身结构与背景（如培养基残留、滤膜纤维）。
- 关注特征性结构（鞭毛、菌毛、荚膜、芽孢）的清晰度和完整性。
- 操作优化：
- 加速电压： 低电压（1-5 kV）可提高表面细节对比度，减少荷电效应和对样品的损伤，是观察细菌的最佳选择。高电压穿透力强，常用于BSE成分分析。
- 工作距离： 较短工作距离（WD）通常提供更高分辨率；较长WD提供更大景深，利于观察不平整表面。
- 束流与光斑尺寸： 较小光斑尺寸配合适度束流可在高倍下获得高分辨率图像；低倍观察或寻找目标区域时可适当增大光斑尺寸和束流。
- 探测器选择与参数调节： 根据观察目的选择SE或BSE探测器，并精细调节对比度、亮度等参数以获得最佳图像。
- 污染控制： 保持样品室清洁，避免有机物污染在样品和探测器上沉积。
五、优势与局限
- 显著优势：
- 高分辨率与高景深： 提供清晰的细菌表面立体形貌，远超光学显微镜。
- 直观三维感： 图像立体感强，易于理解空间结构。
- 样品制备相对成熟： 经过CPD和镀膜处理的样品可长期保存并反复观察。
- 观察尺度范围广： 可从毫米级视野定位到数百纳米级精细结构观察。
- 可结合成分分析（选配EDS）： 部分SEM配备能谱仪（EDS），可进行样品表面微区元素分析。
- 主要局限：
- 样品制备复杂耗时： 固定、脱水、干燥、镀膜等步骤繁琐，且操作不当易引入假象或损坏样品（尤其鞭毛等脆弱结构）。
- 高真空要求： 无法直接观察活体细菌或含水样品中的自然状态（冷冻电镜技术可部分解决此问题）。
- 图像为表面信息： 只能观察表面形貌，无法获得内部结构信息（需TEM）。
- 导电处理要求： 非导电样品必须镀膜，增加了步骤且可能掩盖最表层细节。
- 设备成本与维护要求高。
结论
扫描电子显微镜是深入解析细菌表面精细三维形貌不可或缺的利器。深刻理解其成像原理，熟练掌握并优化关键的样品制备技术（尤其是化学固定、临界点干燥和金属镀膜），并结合严谨的操作参数设置和图像解读，是成功获取高质量细菌SEM图像、准确揭示其形态学特征及其与环境相互作用的基石。尽管存在样品制备复杂、无法观察活体等局限，SEM在细菌分类鉴定、生物膜研究、致病机制探索、抗菌材料评价等领域的应用价值无可替代。随着技术的发展，如低电压成像、冷冻SEM等方法的进步，将持续拓展其在微生物微观世界探索中的深度与广度。
关键词： 扫描电子显微镜 (SEM)；细菌形貌；样品制备；化学固定；临界点干燥 (CPD)；金属镀膜；二次电子成像；生物膜；细菌-宿主相互作用；抗菌材料