死活细胞双染分析

发布时间：2025-07-03 11:52:09 阅读量：1 作者：生物检测中心

死活细胞双染分析：原理、方法与关键应用

一、 技术核心原理

死活细胞双染分析是细胞生物学和毒理学研究中评估细胞群体活力状态的经典技术。其核心在于同时使用两种具有不同细胞膜通透性特征的荧光染料：

  1. 死活细胞膜通透性差异：

    • 活细胞： 具有完整且功能正常的细胞质膜，能有效阻挡某些染料分子进入胞内。
    • 死细胞/膜完整性丧失细胞： 细胞质膜破损或完整性丧失，允许染料自由进出。

  2. 双染料互补指示：

    • 膜不通透染料 (指示活细胞)： 本身不发荧光或荧光很弱（常为酯化衍生物），但能自由穿过活细胞的质膜。一旦进入活细胞，细胞内酯酶将其水解转化为带负电荷、强荧光的极性分子，该分子无法再穿过完整的细胞膜，从而被滞留在活细胞内发出荧光（如绿色荧光）。
    • 膜通透染料 (指示死细胞)： 正常情况下无法穿过完整的活细胞质膜。但当细胞膜受损（坏死、晚期凋亡或机械损伤）时，这类染料能够渗入细胞并结合细胞内特定成分（如核酸），发出强荧光（如红色荧光）。
 

二、 主流染料组合

  1. 钙黄绿素-AM (Calcein-AM) / 碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI)

    • Calcein-AM： 膜通透性染料前体。无色无荧光，自由进入所有细胞。活细胞内的非特异性酯酶将其水解为绿色荧光的钙黄绿素 (Calcein)，后者带负电荷，被保留在活细胞内（发射~515nm绿光）。
    • 碘化丙啶 (PI)： 膜不通透性染料。不能穿透完整细胞膜。仅进入膜破损细胞，与DNA/RNA结合后发出强红色荧光（~617nm红光）。PI也会结合细胞外核酸，染色前需清洗去除死细胞碎片。

  2. 羧基二乙酸荧光素 (Carboxyfluorescein Diacetate, CFDA) / 碘化丙啶 (PI)

    • CFDA： 原理类似Calcein-AM，也是被细胞内酯酶水解后产生绿色荧光的羧基荧光素 (Carboxyfluorescein, CF)。同样标记活细胞。
    • PI： 标记死细胞。

  3. 钙黄绿素-AM / SYTOX系列染料 (如SYTOX Green, SYTOX Red, SYTOX Blue)

    • Calcein-AM： 标记活细胞（绿光）。
    • SYTOX染料： 膜不通透性核酸染料。相比PI，通常具有更高的核酸亲和力、更强的荧光亮度、更优异的光稳定性，且对固定更耐受。不同SYTOX染料发射不同颜色荧光，便于多重染色。SYTOX Green发射绿光，常与发射红光（如EthD-1）或远红光（如DRAQ7）的活细胞染料联用以避免光谱重叠。
 

三、 实验流程概要

  1. 细胞准备： 收获并制备单细胞悬液（贴壁细胞需温和消化），调整细胞密度。
  2. 染料工作液配制： 用合适的缓冲液（如PBS, HBSS）或无血清培养基溶解染料母液，配制工作浓度。
  3. 染色孵育：
    • 加入膜通透性活细胞染料（如Calcein-AM）工作液，混匀。
    • 在适宜温度（通常37°C）避光孵育一段时间（通常15-45分钟），允许染料进入细胞并被水解。
    • 加入膜不通透性死细胞染料（如PI）工作液，混匀。
    • 避光室温或4°C孵育较短时间（通常5-15分钟）。某些方案也支持两种染料同时加入孵育。
  4. 检测分析（无需洗脱）：
    • 荧光显微镜： 快速直观观察。活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光（双染组合为Calcein/PI时）。可定性或半定量分析。
    • 流式细胞术： 最常用且定量准确的检测方法。细胞悬液直接上机分析。通过绿色荧光通道（如FITC通道检测Calcein/CF）和红色荧光通道（如PI通道检测PI）收集信号。需设置合适的单阳性对照和未染色对照调节补偿和设门。可精确定量活细胞、死细胞百分比及群体分布。
    • 荧光酶标仪： 适用于高通量筛选（如药物毒性）。在特定波长下检测孔板中各孔的总荧光强度，间接反映活/死细胞数量比例。敏感性通常低于流式。
 

四、 关键注意事项

  1. 染料浓度与孵育时间优化： 是实验成败关键。浓度过高或孵育过长会导致假阳性（如Calcein-AM过度水解产物可能部分泄漏，PI过度染色背景升高）。需根据具体细胞类型通过预实验滴定最佳条件。
  2. 避免洗涤： 孵育后通常不需洗涤，直接上机分析，以免丢失细胞或破坏染色平衡。若洗涤不可避免（如去除强背景），需极轻柔迅速。
  3. 对照设置（流式分析必备）：
    • 未染色细胞： 设门基础，确定自发荧光背景。
    • 单染Calcein-AM (或CFDA) 细胞： 调节绿色荧光通道电压和补偿。
    • 单染PI (或SYTOX) 细胞： 调节红色荧光通道电压和补偿（补偿通常由PI向Calcein通道调节）。
    • 阳性死细胞对照： 可用乙醇或加热处理的细胞作为100%死细胞对照组。
  4. 细胞状态与密度： 健康、处于对数生长期的细胞染色效果最佳。细胞密度过高可能导致染料消耗不均或细胞聚集影响分析。
  5. 避光操作： 所有步骤需避光，防止染料淬灭。
  6. 数据分析要点（流式）：
    • 正确调节补偿消除光谱重叠干扰。
    • 使用FSC/SSC或特定标记（如DAPI）圈出目的细胞群，排除碎片和聚集细胞。
    • 在双参数点图上，通常以绿色荧光（活细胞染料）为X轴，红色荧光（死细胞染料）为Y轴。
    • 设门区分：
      • 活细胞 (Viable)： 绿色荧光强阳性，红色荧光阴性。
      • 死细胞 (Dead/Necrotic)： 红色荧光强阳性（绿色荧光可能弱或无）。
      • 晚期凋亡/继发性坏死细胞： 可能呈现双阳性（绿色减弱，红色增强）。
      • 碎片： 双阴性或低荧光。
 

五、 核心优势与应用价值

  1. 优势：

    • 直接、快速： 无需长时间培养，染色后短时间内即可获得结果。
    • 直观可视化： 显微镜可直接观察细胞状态。
    • 高灵敏度与定量准确： 流式细胞术可精确定量细胞群体中的活死比例。
    • 区分膜完整性状态： 核心在于评估细胞膜完整性这一关键的生死标志。
    • 适用于多种样本： 悬浮细胞、贴壁细胞（需消化）、组织解离的细胞均适用。
    • 兼容高通量： 流式和酶标仪模式支持高通量筛选。

  2. 广泛应用领域：

    • 细胞毒性/安全性评价： 药物筛选、纳米材料、化学品、环境污染物等对细胞活力的影响。
    • 细胞凋亡与坏死研究： 在研究细胞死亡机制时，结合Annexin V染色（检测早期凋亡的磷脂酰丝氨酸外翻）可区分早期凋亡（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡/坏死（Annexin V+/PI+）和坏死（Annexin V-/PI+）。
    • 细胞培养质量监控： 定期检测传代后或冻存复苏细胞的存活率。
    • 病毒学： 评估病毒感染对宿主细胞的杀伤效应（如病毒滴度测定CPE的定量替代）。
    • 免疫学： 评估免疫细胞（如NK细胞、CTL）的杀伤活性（杀伤实验）。
    • 组织工程与再生医学： 评价生物材料或支架的细胞相容性，监测植入细胞在体外的活力。
    • 微生物学： 评估抗菌剂对细菌/真菌的杀灭效果（需使用微生物特异性的染料或优化方法）。
 

六、 局限性

  1. 仅反映膜完整性： 仅能指示细胞膜是否完整，不能区分细胞死亡的具体机制（凋亡、坏死、焦亡等）。
  2. 依赖细胞内酶活性（活细胞染料）： Calcein-AM/CFDA依赖细胞内酯酶活性。酶活性受抑制的细胞（如某些应激状态或特定抑制剂处理）可能被误判为死细胞。
  3. 染料选择与光谱重叠： 需根据仪器配置选择合适的染料组合，避免荧光光谱严重重叠。
  4. 碎片干扰： 大量细胞碎片可能影响流式和酶标仪结果的准确性，需仔细设门或采用DNA染料（如DAPI、7-AAD）辅助排除。
  5. 不能区分静止期细胞与活跃分裂细胞： 仅指示死活，不反映细胞周期的状态或代谢活跃程度。
 

结论：

死活细胞双染分析凭借其原理清晰、操作相对简便、结果直观且定量准确的优势，成为评估细胞群体活力不可或缺的标准工具。通过选择合适的染料组合（如Calcein-AM/PI）并严格优化实验条件，结合荧光显微镜或流式细胞术等检测平台，研究者能够在基础研究、药物开发、毒性测试、细胞治疗等多个领域高效可靠地获取细胞存活状态的关键信息。理解其原理、操作要点和局限性对于正确解读实验结果至关重要。