细菌黏附抑制率测定

细菌黏附抑制率测定方法

一、引言

细菌在材料表面的黏附是生物被膜形成的初始关键步骤，与医疗器械相关感染、工业管道腐蚀、食品污染等诸多问题密切相关。因此，评估材料、涂层或化合物抑制细菌黏附的能力至关重要。细菌黏附抑制率测定是一种定量评价这种抑制效果的标准实验方法，广泛应用于抗菌材料研发、药物筛选、生物相容性评价等领域。

二、实验原理

该方法基于比较处理组（如涂覆了抗菌涂层或添加了抑制剂的材料）与对照组（未经处理的相同材料）在相同条件下，单位面积或特定表面区域黏附的活菌数量差异。通过计算黏附抑制率，量化处理对细菌初始黏附的阻碍效果。

核心公式：
黏附抑制率 (%) = [1 - (处理组黏附菌量 / 对照组黏附菌量)] × 100%
其中，黏附菌量通常以菌落形成单位（CFU）计数或吸光度（OD）值表示。

三、实验材料与仪器

1. 菌株： 目标测试菌株（如金黄色葡萄球菌 ATCC 25923，大肠杆菌 ATCC 25922）。使用前活化，制备新鲜对数生长期菌悬液。
2. 样品： 待测材料样品（如塑料片、金属片、涂层载玻片、医用导管片段）及相应的未处理对照样品。样品需规格一致，表面清洁、无菌。
3. 培养基： 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）或其他适合目标菌株的培养基。
4. 缓冲液： 无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），用于洗涤。
5. 耗材： 无菌培养皿、无菌离心管、无菌移液管及吸头、无菌96孔细胞培养板（若采用微孔板法）、载玻片等。
6. 仪器：
   • 恒温培养箱
   • 恒温振荡培养箱（摇床）
   • 生物安全柜（超净工作台）
   • 高压蒸汽灭菌锅
   • 离心机
   • 涡旋振荡器
   • 菌落计数器
   • 酶标仪（若采用结晶紫染色法）
   • 超声波清洗仪（用于分散黏附菌，可选）

四、实验步骤

1. 样品准备：

   • 将待测样品和对照样品切割成合适大小（确保能放入培养容器）。
   • 根据实验设计，对样品进行灭菌处理（常用高压蒸汽灭菌、紫外线照射或75%乙醇浸泡后无菌PBS冲洗）。
   • 将灭菌后的样品置于无菌培养皿、24孔板或96孔板孔底中。

2. 菌悬液制备：

   • 从新鲜培养的平板上挑取单菌落接种至适量TSB中。
   • 在适宜温度（通常37℃）下振荡培养（如200 rpm）至对数生长期（通常培养16-18小时）。
   • 取适量培养物离心（如3000-4000 rpm, 10 min），弃上清，用无菌PBS重悬洗涤菌体1-2次。
   • 用无菌PBS调整菌悬液浓度至所需值（通常为10⁵ - 10⁷ CFU/mL，具体浓度根据菌株和材料特性优化），常用0.5麦氏浊度标准作为参考起点。

3. 细菌黏附：

   • 向每个盛放样品的孔/皿中加入等量（如1 mL）制备好的菌悬液，确保液体完全覆盖样品表面。
   • 设置空白对照（仅加PBS，无样品无细菌）和阴性对照（样品加无菌PBS）。
   • 将培养容器置于恒温培养箱或恒温振荡培养箱中，在适宜温度（通常37℃）下孵育特定时间（通常1-2小时，模拟初始黏附阶段）。若在孔板中进行，需注意防止液体蒸发（可加盖或置于湿润环境中）。

4. 洗涤去除未黏附菌：

   • 孵育结束后，小心吸弃或倒出孔/皿中的菌悬液。
   • 用无菌PBS轻柔冲洗样品表面3-4次（每次加入适量PBS，轻轻晃动或使用移液器沿壁缓慢加入/吸出，避免水流直接冲击样品表面导致黏附菌脱落），彻底去除未黏附的浮游细菌。此步骤需严格控制操作力度和时间的一致性。

5. 黏附菌的收集与定量：

   • 方法一：CFU 计数法（最常用，直接反映活菌数）
     • 向每个样品孔/皿中加入一定体积（如1 mL）的无菌PBS或生理盐水。
     • 将样品（或连同液体）转移至含有适量无菌玻璃珠或磁珠的无菌管中（或直接在孔板中用刮刀刮下）。
     • 涡旋振荡（或超声处理）一定时间（如1-3分钟），充分振荡/超声使黏附在材料表面的细菌分散到液体中，形成均匀的菌悬液。
     • 将菌悬液进行系列10倍梯度稀释（通常稀释10⁻¹至10⁻³倍）。
     • 取各稀释度菌悬液100 µL，分别均匀涂布于TSA平板上。
     • 将平板倒置，在适宜温度下培养24-48小时。
     • 计数平板上的菌落数（CFU），计算每个样品上黏附的总活菌数（CFU/样品）。
   • 方法二：结晶紫染色法（间接反映总黏附菌量，包括死菌）
     • 适用于96孔板等微孔体系。
     • 洗涤后，向每孔加入100 µL 0.1% (w/v) 结晶紫溶液，室温染色15-30分钟。
     • 吸弃染色液，用无菌水或PBS轻柔冲洗数次，直至冲洗液无色，去除多余染料。
     • 待孔板干燥后，向每孔加入200 µL 95%乙醇（或33%醋酸溶液）溶解与细菌结合的结晶紫。
     • 将孔板置于酶标仪中，在波长570 nm（或600 nm）处测定吸光度（OD）值。OD值间接反映黏附的细菌总量。

6. 数据处理与计算：

   • 计算对照组和处理组样品黏附菌量的平均值（分别记为 CFU_control 或 OD_control 和 CFU_treated 或 OD_treated）。
   • 使用核心公式计算细菌黏附抑制率：
     抑制率 (%) = [1 - (CFU_treated / CFU_control)] × 100% (CFU法)
     抑制率 (%) = [1 - (OD_treated / OD_control)] × 100% (结晶紫法)
   • 结果应以“平均值 ± 标准差”表示，并进行统计学分析（如t检验或ANOVA），以判断处理组与对照组差异是否显著（通常p<0.05认为有统计学意义）。
   • 可视化：绘制柱状图展示各组黏附菌量及计算得到的抑制率。

五、结果解释与应用

• 抑制率 > 0%： 表明处理具有抑制黏附的效果。抑制率越高，抑制效果越强。
• 抑制率 ≈ 0%： 表明处理对细菌黏附无明显影响。
• 抑制率 < 0%： 表明处理反而促进了细菌黏附（罕见，可能提示材料表面性质改变利于黏附）。
• 应用：
  • 评价新型抗菌涂层、抗黏附材料的有效性。
  • 筛选具有抗黏附活性的化合物或天然产物。
  • 研究不同材料表面理化性质（如亲疏水性、电荷、粗糙度）对细菌黏附的影响。
  • 评估医疗器械表面的生物相容性和抗感染潜力。

六、注意事项

1. 标准化： 实验条件（菌液浓度、孵育时间、温度、洗涤力度、振荡/超声参数）必须严格保持一致，以保证结果的可重复性和可比性。
2. 无菌操作： 整个过程在生物安全柜中进行，确保无菌，避免污染。
3. 样品表征： 准确了解样品的表面性质（成分、粗糙度、接触角等）对结果解读至关重要。
4. 表面预处理： 材料在测试前应充分清洁，去除可能影响黏附的污染物。
5. 菌株选择： 选择与研究目标相关的代表性菌株。
6. 孵育环境： 静态或动态（振荡）孵育会影响黏附效果，需根据实际应用场景选择。
7. 温度控制： 孵育和操作过程中的温度需保持恒定。
8. 结果解读： CFU法反映活菌黏附，结晶紫法反映总菌黏附（包括死菌）。两者结果可能不完全一致，需根据研究目的选择合适方法并合理解读。通常CFU法更受青睐。
9. 平行实验： 每组实验需设置足够数量的平行样本（通常n≥3），以降低误差。

结论

细菌黏附抑制率测定是评估材料、涂层或化合物抑制细菌初始定植能力的核心定量方法。通过严谨的实验设计、标准化的操作流程和准确的定量分析（CFU计数为主），该方法为研发抗感染材料、优化医疗器械表面性能及研究细菌-材料相互作用机制提供了可靠的科学依据。理解并控制实验中的关键变量是获得准确、可重复结果的前提。