纳米材料MIC50/90值测定

发布时间：2025-07-03 11:27:02 阅读量：1 作者：生物检测中心

纳米材料最小抑菌浓度(MIC50/90)测定标准指南

摘要：
最小抑菌浓度（MIC）是评价抗菌物质效力的关键指标。MIC50指抑制50%受试微生物生长的最低物质浓度，MIC90指抑制90%微生物生长的最低浓度。本指南详细阐述了测定纳米材料MIC50/90值的标准化实验方法，涵盖原理、材料准备、操作流程、结果判读及质量控制要点，为客观评价纳米材料的抗菌性能提供技术依据。

一、 引言
随着纳米技术的发展，纳米材料因其独特的物理化学性质（如高比表面积、小尺寸效应、可修饰性强等），在抗菌领域展现出巨大潜力。准确评估其抗菌活性是研发和应用的基础。MIC值测定是体外评价抗菌活性的经典、定量方法。本方法适用于各类具备潜在抗菌活性的纳米材料（如金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒、碳基纳米材料、纳米复合材料等）对细菌或真菌的敏感性测试。

二、 原理
采用微量肉汤稀释法。将待测纳米材料在特定液体培养基中进行系列倍比稀释，加入适量标准化的微生物悬液，在适宜条件下培养。通过肉眼观察或仪器检测各孔培养物的浊度（指示微生物生长情况），记录无可见微生物生长的最低纳米材料浓度，即为该菌株对该纳米材料的MIC值。统计多株同种微生物的MIC值，可计算出MIC50和MIC90。

三、 实验材料与仪器

  1. 受试纳米材料： 提供准确的化学组成、尺寸、形态、表面电荷（Zeta电位）、分散稳定性等信息。使用前需充分表征（如TEM/SEM, DLS, XRD等）。
  2. 受试微生物： 标准菌株或临床分离株。常用参考菌株（如：Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC 90028）。需活化并验证纯度。
  3. 培养基：
    • 细菌：Mueller-Hinton肉汤（MHB），对于苛养菌根据需要选用特定培养基（如嗜血杆菌试验培养基HTM，肺炎链球菌需补充溶解马血或5%羊血的MHB）。
    • 酵母菌：RPMI 1640培养基（含MOPS缓冲液，pH 7.0）或酵母氮基肉汤（YNB）。
  4. 主要仪器： 生物安全柜、恒温培养箱、振荡培养箱（可选）、酶标仪（用于定量测定吸光度OD值）、微量移液器及配套无菌吸头、无菌96孔微量培养板（U型或平底）、涡旋混合器、菌落计数器（备用）、离心机（用于菌体洗涤）。
  5. 其他： 无菌生理盐水（0.85-0.9% NaCl）、无菌蒸馏水、二甲亚砜（DMSO，用于难溶纳米材料的初始溶解，终浓度<1%）、阳性对照药物（如庆大霉素用于细菌，氟康唑用于酵母菌）、阴性对照（不含纳米材料和菌液的培养基）。
 

四、 实验步骤

  1. 纳米材料储备液制备：

    • 精密称取适量纳米材料粉末。
    • 选择合适溶剂（常用无菌蒸馏水、生理盐水或含0.05%吐温-80的水溶液以提高分散性），充分涡旋振荡。
    • 关键步骤： 进行强力超声处理（如冰浴超声探头处理10-30分钟），以获得均匀、稳定的分散液。超声参数（功率、时间、间歇）需优化并记录。
    • 用相应溶剂将储备液浓度调整至最高测试浓度的2倍（如目标最高浓度为1024 μg/mL，则储备液为2048 μg/mL）。无菌过滤（若材料尺寸允许且不影响性质）或确保无菌操作。
    • 注意：需验证超声处理后纳米材料的性质（如尺寸、聚集状态）是否发生显著变化。

  2. 菌悬液制备：

    • 从新鲜培养（通常18-24小时）的琼脂平板上挑取4-5个形态一致的菌落。
    • 接种于适量液体培养基中，在适宜温度下振荡培养至对数生长期中期（通常细菌培养2-6小时，酵母菌培养至OD值符合要求）。
    • 用无菌生理盐水或特定培养基洗涤菌体（离心去上清，重悬）至少一次，以去除代谢产物干扰。
    • 用生理盐水或培养基调整菌悬液浊度至0.5麦氏标准（约1-2 x 10^8 CFU/mL 细菌；约1-5 x 10^6 CFU/mL 酵母孢子）。
    • 关键步骤： 用测试培养基将上述菌悬液进一步稀释至最终接种浓度（通常细菌：5 x 10^5 CFU/mL；酵母菌：0.5-2.5 x 10^3 CFU/mL）。此即“工作菌悬液”。

  3. 96孔板加样：

    • 标记好96孔板（行：不同纳米材料浓度；列：平行重复及对照）。
    • 第1列： 加入100μL无菌水（或溶剂）作为空白对照（不含菌）。
    • 第2列： 加入100μL工作菌悬液作为生长对照（含菌，无药物）。
    • 第3列（可选）： 加入100μL含已知MIC值标准抗菌药的培养基作为阳性药物对照。
    • 第4-12列（或更多）： 用于纳米材料测试。
      • 在最高浓度孔（如A4）加入100μL 2倍浓度的纳米材料储备液（如2048 μg/mL）。
      • 在A5孔加入50μL培养基和50μL A4孔的溶液，混匀后吸出50μL加入A6孔，以此类推进行倍比稀释（通常是2倍稀释）至最低浓度孔（如A12）。弃去A12孔中多余的50μL溶液。
      • 关键步骤： 确保每孔液体体积为50μL（稀释好的纳米材料溶液）。
      • 向第4-12列的每孔中加入50μL工作菌悬液。此时每孔总体积为100μL，纳米材料浓度已被稀释1倍（如A4孔最终浓度为1024 μg/mL），菌浓度达到目标接种量。
    • 所有操作在生物安全柜内无菌进行。

  4. 培养：

    • 用无菌封口膜或盖板密封培养板，防止蒸发。
    • 将培养板置于适宜温度的恒温培养箱中静置培养（细菌：35±2°C；酵母菌：35±2°C，部分需28-30°C）。培养时间依据微生物生长速度确定（通常细菌：16-20小时；酵母菌：24-48小时）。避免晃动。

  5. 结果判读：

    • 肉眼观察（浊度法）：
      • 取出培养板，置于暗背景明亮光线下观察。
      • 与生长对照孔（应明显浑浊）比较。
      • 无菌生长孔： 液体清澈透明，底部无可见沉淀或沉淀物明显少于生长对照孔。
      • 有菌生长孔： 液体出现可见浑浊或底部有明显沉淀。
      • MIC值确定： 无菌生长的最低纳米材料浓度孔所对应的浓度即为该菌株对该纳米材料的MIC值。
    • 酶标仪测定（定量法，推荐）：
      • 设定合适波长（通常600nm左右测细菌浊度，530nm或更高测酵母以减少干扰），测定各孔吸光度值（OD）。
      • 计算各孔的微生物生长抑制率：抑制率(%) = [(OD生长对照孔平均 - OD空白对照孔平均) - (OD样品孔 - OD空白对照孔平均)] / (OD生长对照孔平均 - OD空白对照孔平均) * 100%。
      • MIC值确定： 抑制率 ≥ 80%（或 ≥ 90%，依据标准定义）的最低纳米材料浓度通常判读为MIC值。需与肉眼观察结果结合判断终点。
    • MIC50/90计算： 测定足够数量（通常≥10株）同种微生物（如同一菌种的不同菌株）的MIC值。将所有MIC值从小到大排序。MIC50是该有序列表中第50百分位数对应的MIC值（即抑制50%菌株生长的浓度）；MIC90是第90百分位数对应的MIC值。
 

五、 质量控制与注意事项

  1. 质控菌株： 每次实验必须同时测定标准质控菌株（如S. aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922等），其对应标准药物的MIC值应在CLSI或EUCAST等权威机构公布的预期范围内，否则实验无效。
  2. 对照有效性：
    • 空白对照：应清澈无浊度。
    • 生长对照：应有明显的微生物生长（浊度或足够高的OD值）。
    • 阳性药物对照：MIC值应在预期范围内。
  3. 接种量准确性： 涂布平板计数法验证工作菌悬液的实际接种浓度至关重要。
  4. 纳米材料分散性与稳定性：
    • 这是纳米材料MIC测试的最大挑战。实验过程中需密切观察有无聚集沉淀。
    • 优化超声分散参数和使用表面活性剂是常用手段，但需评估其对材料活性及微生物的影响。
    • 考虑在培养不同时间点取样测定粒径和Zeta电位，监控稳定性。
  5. 离子释放： 对于金属纳米颗粒，溶解的金属离子可能是主要活性成分。需考虑测定培养液中的离子浓度，并与MIC结果关联分析。
  6. 吸附作用： 纳米材料可能吸附培养基成分或微生物，干扰结果。需设计对照实验评估影响。
  7. 光敏性： 对于某些纳米材料（如TiO2），光照可能显著影响其活性。需明确并控制实验环境的光照条件。
  8. 重复性： MIC测定结果应具有可重复性。同一菌株对同一批次纳米材料至少进行3次独立实验。
  9. 溶剂对照： 若使用了助溶剂（如DMSO），必须设置相应溶剂浓度的对照孔（不含纳米材料），确保溶剂本身不影响微生物生长。
  10. 终点判读： MIC是特定实验条件下的一个点估计值，判读时需结合抑制率计算和肉眼观察，尤其是对于抑菌作用非陡峭的纳米材料。
 

六、 结果报告
报告应清晰、完整地包含以下信息：

  1. 受试纳米材料的详细表征信息（组成、尺寸、形貌、表面性质等）。
  2. 受试微生物的名称、菌株号（如ATCC号）、来源。
  3. 所用培养基名称、批号、pH值。
  4. 纳米材料储备液配制方法（溶剂、浓度、分散处理方式）。
  5. 最终接种量（CFU/mL）。
  6. 培养条件（温度、时间、是否振荡）。
  7. 每个受试菌株的MIC值（单位：μg/mL）。
  8. 计算所得的MIC50和MIC90值（单位：μg/mL）及对应的菌株数量。
  9. 质量控制结果（质控菌株对标准药物的MIC是否合格）。
  10. 实验中的关键观察（如纳米材料分散稳定性、有无特殊沉淀现象等）。
  11. 结果判读方法（肉眼浊度法或OD法，抑制率阈值）。
  12. 实验日期、操作者。
 

七、 结论
微量肉汤稀释法是测定纳米材料MIC50/90值的有效方法。然而，纳米材料的特殊理化性质（尤其是分散稳定性）对结果可靠性构成显著挑战。严格遵守本指南中的标准化操作流程和质量控制要求，充分表征材料并关注其在测试体系中的行为，对于获得准确、可重复、具有可比性的MIC50/90数据至关重要。这些数据为评估纳米材料的体外抗菌谱、效力比较和作用机制研究提供了重要的基础信息。未来方法学研究需持续聚焦于解决纳米材料在生物介质中的表征与稳定性问题。

注： 本指南基于CLSI M07/M27/M38等标准文件的原则，并针对纳米材料的特殊性进行了调整和补充。实际研究中应密切关注相关领域最新方法学进展和标准更新。