纳米材料真菌抑制率检测 - 中析研究所生物检测中心

纳米材料真菌抑制率检测：方法与要点

一、引言

真菌污染广泛存在于医疗、食品、农业、工业材料等多个领域，不仅造成经济损失，更威胁人类健康与环境安全。传统抗真菌剂存在耐药性、环境残留及潜在毒性等问题。纳米材料凭借其独特的物理化学性质（如小尺寸效应、高比表面积、可表面功能化），展现出高效、广谱且不易诱发耐药性的抗真菌潜力。准确评估纳米材料对真菌生长的抑制效果（真菌抑制率），是筛选高效抗真菌纳米材料、研究其作用机制及推动应用的关键步骤。

二、基本原理

纳米材料主要通过以下机制抑制真菌生长：

物理损伤： 尖锐的纳米结构（如纳米氧化锌、纳米银）可刺穿真菌细胞壁/膜；纳米材料在真菌表面或内部聚集亦可破坏其结构完整性。
氧化应激： 某些纳米材料（如TiO₂光催化材料、含金属离子的纳米颗粒）能产生活性氧（ROS），导致真菌细胞内脂质、蛋白质、DNA等生物大分子氧化损伤。
离子释放： 金属/金属氧化物纳米颗粒（如Ag⁺、Cu²⁺、Zn²⁺）释放的游离离子干扰真菌细胞内离子平衡、破坏酶活性或与细胞成分结合。
靶向作用： 表面修饰的纳米材料可特异性地结合真菌细胞壁组分（如几丁质、葡聚糖），干扰其代谢或促使其内化。
真菌抑制率通常定义为在一定条件下（时间、浓度），经纳米材料处理的真菌生长量（如菌落直径、生物量、代谢活性）相对于未处理对照组（空白对照）减少的百分比，是量化抗真菌活性的核心指标。

三、常用检测方法

琼脂扩散法（Kirby-Bauer法改进）
- 原理： 纳米材料在琼脂平板中扩散形成浓度梯度，抑制周围真菌生长形成抑菌圈。
- 步骤：
  1. 制备真菌孢子/菌丝悬浮液，调整至标准浓度（如1×10⁶ CFU/mL）。
  2. 将悬浮液均匀涂布于固体琼脂平板（如PDA，马铃薯葡萄糖琼脂）。
  3. 在平板表面放置无菌滤纸片或打孔，将不同浓度的纳米材料分散液（或纳米材料直接负载的载体）加入孔中/置于纸片上。
  4. 适宜温度下培养一定时间（通常24-72小时，视真菌生长速度而定）。
  5. 测量抑菌圈直径（毫米）。
- 计算： 抑菌圈大小直观反映抑制能力，但主要用于定性或半定量比较不同材料的抑菌活性，通常不直接计算抑制率。抑菌圈直径越大，抑制效果越强。需设置溶剂或分散剂作为阴性对照。
液基微量稀释法（CLSI M38 / M27 标准改进）
- 原理： 在液体培养基（如RPMI 1640）中，将纳米材料进行系列倍比稀释，加入定量真菌孢子/菌丝悬浮液，培养后测定抑制生长所需的最低浓度（MIC）或用显色法测定抑制率。
- 步骤：
  1. 在96孔板中，用液体培养基对纳米材料进行系列倍比稀释（如100, 50, 25, 12.5, ... μg/mL）。
  2. 每孔加入标准浓度的真菌孢子/菌丝悬浮液。
  3. 设置不含纳米材料但含真菌的孔作为生长对照（100%生长）；不含纳米材料且不含真菌的孔作为空白对照（背景值）。
  4. 适宜温度下振荡培养一定时间（通常24-48小时）。
  5. 抑制率测定：
    - 浊度法（OD值）： 用酶标仪测定各孔在特定波长（如600nm）的光密度（OD）。真菌生长导致浊度增加，OD值升高。
    - 显色法（MTT/XTT）： 加入MTT或XTT试剂，活细胞线粒体脱氢酶将其还原为紫色（甲臜）或橙色（甲臌）甲瓒，溶解后测OD值。活细胞越多，OD值越高。
- 计算：

真菌抑制率 (%) = [1 - (OD样品孔 - OD空白孔) / (OD生长对照孔 - OD空白孔)] × 100%

* 样品孔：含纳米材料和真菌的孔。 * 生长对照孔：不含纳米材料但含真菌的孔。 * 空白孔：不含纳米材料且不含真菌的孔（仅培养基）。 * 通过计算不同浓度纳米材料的抑制率，可绘制浓度-效应曲线，确定MIC（抑制率≥90%或肉眼无菌生长对应的最低浓度）和半最大效应浓度（EC₅₀）。 * **优势：** 定量精确，可测定MIC/EC₅₀，适用于高通量筛选。

3. 菌落计数法
* 原理： 将经纳米材料处理后的真菌悬浮液进行稀释涂布，培养后计数存活菌落形成单位（CFU），计算杀灭率或抑制率。
* 步骤：
1. 真菌孢子/菌丝悬浮液与不同浓度的纳米材料分散液混合，作用一定时间。
2. 取出混合液，进行适量稀释（中和残留纳米材料活性）。
3. 取一定体积的稀释液涂布于固体琼脂平板。
4. 适宜温度下培养一定时间，计数平板上的菌落数（CFU）。
5. 设置未经纳米材料处理的真菌悬浮液作为阳性对照。
* 计算：

真菌杀灭率 (%) = [1 - (处理后样品CFU / 阳性对照CFU)] × 100%

真菌抑制率 (%) = [(阳性对照CFU - 处理后样品CFU) / 阳性对照CFU] × 100%

*(杀灭率强调致死效果，抑制率强调生长被阻止的效果，数值上非常接近，表述侧重点不同)* * **优势：** 直接反映活菌数量变化，结果直观，尤其适用于评估杀菌效果。

四、实验关键步骤与注意事项

纳米材料分散：
- 团聚是影响结果准确性的首要问题。必须使用适当的分散方法（如超声、添加稳定分散剂如PVP、吐温80）和条件（时间、功率），确保纳米材料在培养基中均匀稳定分散。需验证分散状态（如动态光散射DLS测粒径分布）。
- 分散剂本身必须进行对照实验，确认其对真菌生长无影响。
真菌种类与状态：
- 选择具有代表性的目标致病真菌或污染真菌（如白色念珠菌、黑曲霉、黄曲霉、镰刀菌等）。
- 使用标准化菌株（如ATCC菌株）。
- 确保接种物为新鲜、活性良好的孢子或菌丝悬液，浓度需精确标准化。
浓度表示与范围：
- 浓度单位需明确（通常为质量浓度 μg/mL 或 mg/L），避免使用摩尔浓度（除非分子组成明确单一）。
- 测试浓度范围应足够宽，应涵盖无明显抑制到近乎完全抑制的区间，以准确确定MIC/EC₅₀。
培养基与培养条件：
- 选择适合目标真菌生长的标准培养基（如PDA用于霉菌，Sabouraud或RPMI 1640用于酵母）。
- 严格控制培养温度、湿度和时间（需预实验确定对数生长期）。
对照设置：
- 阴性对照（溶剂/分散剂对照）： 仅含分散纳米材料所用的溶剂或分散剂（浓度与样品组最高浓度一致）和真菌，用于排除溶剂/分散剂的干扰。
- 阳性对照（生长对照）： 不含纳米材料但含真菌。
- 空白对照： 不含纳米材料且不含真菌（仅培养基），用于校正背景值（尤其是OD测定时）。
- 标准药物对照（可选）： 使用已知抗真菌药物（如两性霉素B、氟康唑），验证实验体系的有效性，并可对比纳米材料活性。
作用时间： 作用时间需明确规定并在报告中说明，不同时间点结果可能不同。
结果判定与统计学：
- 每个浓度需设置平行样（通常≥3个），结果以均值±标准差表示。
- 使用适当的统计学方法（如t检验、ANOVA）分析显著性差异。
纳米材料特性的影响：
- 纳米材料在培养基中的稳定性（是否沉降、团聚、溶解、释放离子）会随时间变化，需考虑其对结果的影响。
- 纳米材料的潜在光催化活性（如TiO₂）是否在实验中被激发（光照条件）？
- 细胞毒性评估（非常重要）： 高效的抗真菌纳米材料必须评估其对哺乳动物细胞的毒性，以确保其应用的安全性选择性指数（对真菌EC₅₀与对哺乳动物细胞TC₅₀或IC₅₀的比值）是重要评估指标。

五、结论

准确测定纳米材料的真菌抑制率是评估其抗真菌性能和筛选潜在应用候选物的基石。琼脂扩散法简单直观，适用于初步筛选；液基微量稀释法精确量化，可确定MIC/EC₅₀，是主流方法；菌落计数法直接反映活菌数变化，评估杀菌效果可靠。无论采用何种方法，严格控制实验条件（尤其是纳米材料的均匀稳定分散）、规范操作流程、合理设置对照并进行严格的统计学分析至关重要。此外，必须将抗真菌效力与其对哺乳动物细胞的潜在毒性结合评估，方能全面评价纳米材料的安全性和应用前景。随着纳米科学的发展，建立更标准化、更能反映实际应用场景（如生物膜模型）的真菌抑制率检测方法，仍是该领域的重要研究方向。