酵母菌和霉菌总数测定：理解意义与方法
一、 概述：为何检测酵母菌和霉菌总数？
酵母菌和霉菌是环境中广泛存在的微生物，它们在食品、药品、化妆品、环境和临床等多个领域都具有重要意义：
- 指示卫生状况： 其数量能反映原料、生产环境、设备卫生、人员操作及最终产品的微生物污染程度，特别是清洁消毒措施的有效性。
- 评估产品安全性：
- 致病风险： 部分霉菌（如黄曲霉、赭曲霉等）能产生强效的致癌毒素（如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A）。
- 腐败变质： 它们是导致食品、药品、化妆品等腐败变质的主要微生物之一，影响外观、质地、风味和营养价值，导致经济损失。
- 过敏原： 某些霉菌孢子是常见的空气过敏原。
- 保障产品稳定性： 在产品保质期内，控制其数量是确保产品质量稳定、符合法规要求和消费者期望的关键。
- 追溯污染源： 检测有助于识别污染环节，优化生产过程控制。
因此，酵母菌和霉菌总数（Total Yeast and Mold Count, TYMC）是一项至关重要的微生物学指标，用于评估样品整体的卫生质量、安全性和稳定性潜力。
二、 检测原理与方法
国际通用的标准方法（如ISO 21527系列、USP <61>、GB 4789.15等）主要基于平板计数法：
-
培养基选择：
- 最常用： 含抗生素（氯霉素或金霉素等）的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）或玫瑰红钠琼脂（孟加拉红琼脂）。抗生素抑制细菌生长，允许酵母菌和霉菌生长。
- 低pH培养基： 如酸性PDA (pH 3.5±0.1)，利用低pH环境选择性抑制细菌。
- 高水活度产品： 也可选用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（YPD）。
-
样品制备与稀释：
- 按标准无菌操作制备具有代表性的样品匀液。
- 根据预期污染程度，对匀液进行系列十倍稀释（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³...），以获得适宜计数的平板（通常目标菌落数在15-150 CFU/平板）。
-
接种与培养：
- 选择2-3个适宜的稀释度，每个稀释度接种2个平板。
- 倾注法：取1mL稀释液于无菌平皿中，倾注冷却至约45°C的培养基，混匀凝固。
- 涂布法：取0.1mL稀释液涂布于预先凝固的培养基表面。
- 培养温度与时间： 通常在25-30°C下培养（常用28±1°C）。培养时间一般为5天（120小时）。部分生长缓慢的霉菌可能需要培养至7天或更久。培养期间需保持一定湿度防止培养基干燥。
-
菌落计数与鉴别：
- 酵母菌菌落： 通常湿润、光滑、奶油状、不透明、边缘整齐，大小相对均匀（但种类不同大小差异也大）。
- 霉菌菌落： 通常呈绒毛状、絮状、蛛网状或粉末状，表面干燥，可呈现多种颜色（绿、黑、黄、白、褐等），边缘不规则，大小差异显著。
- 计数所有典型酵母菌和霉菌菌落。区分两者有时需要经验，必要时可挑取菌落进行显微镜观察（酵母菌多为单细胞卵圆形/球形/出芽；霉菌为丝状菌丝）。
-
结果计算与报告：
- 选择菌落数在15-150 CFU之间的平板进行计数。
- 计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。
- 按公式计算样品中酵母菌和霉菌总数：
TYMC (CFU/g 或 CFU/mL) = 平均菌落数 × 稀释倍数。 - 报告结果应注明单位（如CFU/g, CFU/mL）和所用方法的关键参数（如培养基类型、培养温度和时间）。
三、 结果解读与注意事项
- 解读依据： 结果需参照相关产品的法规标准、行业规范、企业内部质量控制标准或合同要求进行判读。不同产品对酵母菌和霉菌总数的限量要求差异很大。
- 数据意义：
- 数值高低： 直接反映样品受酵母菌和霉菌污染的程度。
- 种类分析（若进行）： 识别是否存在产毒霉菌或其他特定问题菌株至关重要（如食品中检出黄曲霉、药品中检出可能致敏的霉菌）。
- 关键注意事项：
- 无菌操作： 整个过程必须严格遵守无菌操作规程，避免引入外源性污染。
- 样品代表性： 取样需具有代表性。
- 培养基质量控制： 使用前需确认培养基的无菌性、pH值和选择性（如抗生素活性）。定期使用标准菌株（如黑曲霉、白色念珠菌）验证培养基促生长能力。
- 稀释均匀性： 确保稀释过程中充分混匀。
- 培养条件： 严格控制培养温度和湿度，确保一致性。培养期间可定期观察菌落生长情况。
- 计数准确性： 区分酵母菌、霉菌和可能的细菌菌落（偶有抗性菌生长），注意蔓延菌落的处理（按单个菌落计数或标记区域）。
- 培养时间： 确保足够的培养时间，尤其是对生长缓慢的霉菌。最终计数应在规定时间结束时进行。
- 阳性对照与阴性对照： 每次检测应包含适当的阳性质控（标准菌株）和阴性质控（无菌稀释液）以确保方法可靠性。
- 假阳性风险： 在低pH培养基或高渗环境下，某些细菌（如乳酸菌）也可能生长，需注意鉴别。
四、 质量控制的重要性
可靠的酵母菌和霉菌总数检测结果依赖于严格的质量控制体系：
- 培养基性能验证
- 设备校准（培养箱、天平、移液器等）
- 人员培训与考核
- 环境监控（洁净室/操作台沉降菌、浮游菌）
- 标准菌株管理
- 定期参与能力验证或实验室间比对
总结：
酵母菌和霉菌总数检测是评估产品卫生质量、安全风险（尤其霉菌毒素风险）和稳定性的核心微生物学手段。采用标准化的平板计数法，结合严格的无菌操作、质量控制和对培养物特征的准确辨识，是获得可靠结果的基础。正确解读检测数据，对于保障消费者健康、产品质量合规以及指导生产过程优化具有不可替代的作用。持续关注检测方法和标准的更新，并强化实验室质量管理，是确保检测结果科学、准确、有效的关键。