益生菌载量验证

发布时间：2025-07-03 10:51:33 阅读量：1 作者：生物检测中心

益生菌载量验证：定义、流程与质量控制

一、 定义与核心目标

益生菌载量验证是指通过科学、标准化的实验室检测方法，对益生菌产品（包括但不限于粉剂、胶囊、片剂、液体饮料等）中特定活性益生菌菌株的数量进行准确测定和确认的过程。其核心目标在于：

  1. 确保产品宣称有效性： 验证产品中活性益生菌的数量是否达到标签标示值或特定功能声称所需的阈值水平，这是发挥其健康功效的基础。
  2. 保证产品质量一致性： 监控不同生产批次间益生菌活菌数的稳定性和一致性，是产品质量控制的核心环节。
  3. 符合法规要求： 满足国家或地区关于食品、膳食补充剂或药品中对微生物含量标示的法规要求，保障产品合规上市。
  4. 指导生产工艺优化： 为生产工艺（如发酵、冻干、包埋、混合、压片/灌装、包装、储存）的改进提供数据支持，提高活菌存活率和稳定性。
  5. 建立货架期稳定性数据： 确定产品在保质期内活菌数的衰减情况，为制定合理的保质期和储存条件提供依据。
 

二、 验证核心流程

益生菌载量验证是一个系统且严谨的过程，通常包含以下关键步骤：

  1. 方法开发与选择：

    • 目标菌株确认： 明确需要检测的具体益生菌菌株（如嗜酸乳杆菌 NCFM、动物双歧杆菌 BB-12、鼠李糖乳杆菌 GG 等）。多菌株产品需针对每种目标菌株建立检测方法。
    • 检测方法选择： 基于目标菌株的特性、产品基质和检测目的，选择最合适的定量方法：
      • 平板计数法 (Plate Count)： 最经典、应用最广泛的方法。通过梯度稀释样品，将稀释液涂布或倾注在选择性/非选择性固体培养基上，在适宜条件下培养后计数形成的菌落形成单位 (CFU)。优点：直观、成本较低、直接计数活菌。缺点：耗时长（通常需 24-72 小时以上），对某些难培养或受损菌株可能低估活菌数，受培养基选择性和操作影响较大。
      • 流式细胞术结合活性染料 (Flow Cytometry with Viability Stains)： 利用荧光染料区分活菌、死菌和受损细胞，通过流式细胞仪快速计数。优点：快速（数小时）、可区分不同生理状态、高通量。缺点：仪器成本高，需要专业操作人员，对样品前处理和染料选择要求高。
      • 定量聚合酶链式反应 (qPCR)： 检测特定菌株的 DNA 片段。通常用于菌株特异性鉴定和定量。优点：高特异性、高灵敏度、快速。缺点：无法区分活菌和死菌（除非结合活菌预处理如叠氮溴化丙啶），DNA 提取效率影响结果。
      • 数字 PCR (dPCR)： qPCR 的升级版，提供绝对定量，对抑制剂不敏感。优点：精确度高、绝对定量。缺点：成本更高，通量相对较低。
      • 其他方法： 如显微镜直接计数（无法区分死活）、阻抗法、ATP 生物发光法等，应用相对较少。
    • 方法优化与确认： 针对选定的方法，优化样品前处理步骤（如均质方法、缓冲液选择、去除干扰物、复苏培养条件等）、培养基配方、培养条件（温度、时间、气体环境）、染色条件或 PCR 引物/探针、反应条件等。进行方法学验证（见下文）。

  2. 方法学验证：
    在正式用于产品检测前，必须对所选方法进行全面的验证，以证明其适用于特定产品和目标菌株的检测需求。验证参数通常包括：

    • 特异性 (Specificity)： 方法能准确区分并定量目标益生菌菌株，不受产品中其他成分（如辅料、其他菌株、基质）或杂菌干扰。
    • 准确性 (Accuracy)： 检测结果与真实值（通常用有证标准物质或加标回收率评估）的接近程度。通常要求回收率在 80%-120% 范围内。
    • 精密度 (Precision)： 包括重复性 (Repeatability，同一操作者在短时间内多次检测同一均质样品) 和中间精密度 (Intermediate Precision，不同日期、不同操作者、不同设备对同一均质样品的检测)。通常以相对标准偏差 (RSD) 表示，要求 RSD ≤ 10% (高载量) 或 ≤ 35% (低载量)。
    • 线性范围 (Linearity)： 方法在预期检测范围内，其响应值与目标菌株数量之间呈线性关系。
    • 检测限 (Limit of Detection, LOD) 与定量限 (Limit of Quantitation, LOQ)： LOD 是可被检测到的最低菌量（但未必能准确定量），LOQ 是能准确定量的最低菌量。LOQ 通常设定为方法可接受精密度和准确度下的最低浓度点。
    • 稳健性/耐用性 (Robustness/Ruggedness)： 检测条件（如培养温度波动 ±1°C、孵育时间 ±10%、试剂批次变化）发生微小变动时，方法保持结果稳定的能力。

  3. 样品采集与处理：

    • 代表性取样： 严格按照抽样方案（如 GB 4789.1）从批次产品中抽取具有代表性的样品，避免因产品不均匀导致误差。
    • 样品储存与运输： 在规定的温湿度条件下（通常低温如 4°C 或冷冻）及时运输和储存样品，防止活菌数在检测前发生显著变化。
    • 样品前处理： 在无菌条件下进行。对于固体产品（粉、片、胶囊），需精确称量后溶解或悬浮于适宜的缓冲液（如磷酸盐缓冲液、蛋白胨水）中，并充分均质（如拍打式均质器、漩涡混合器）。可能需要去除干扰成分（如油脂、颗粒物）或添加中和剂（如针对包埋材料）。对于液体产品，可直接稀释或离心富集。稀释过程需无菌操作并充分混匀。

  4. 检测分析：

    • 严格按照经过验证的标准操作规程 (SOP) 进行操作。
    • 根据预期载量和方法的 LOQ/线性范围，进行合适的梯度稀释。
    • 执行选定的检测方法（涂布平板、倾注平板、流式上机、PCR 扩增等）。
    • 记录所有实验细节（样品信息、操作者、日期时间、试剂批号、设备、培养条件、原始数据等）。

  5. 结果计算与报告：

    • 根据检测方法计算活菌数（如 CFU/g 或 CFU/mL）。
    • 考虑稀释倍数、样品量等因素。
    • 报告结果时需包含：目标菌株名称、检测方法、最终载量值（通常以科学计数法表示，如 1.0 × 10^9 CFU/g）、单位、检测日期、批次号等信息。
    • 结果需与产品标签标示值或内部质量标准进行比较，判定是否符合要求。
 

三、 关键挑战与注意事项

  1. 菌株特异性与选择性： 多菌株产品需确保方法能特异性地检测目标菌株，避免其他共生菌株或杂菌干扰。选择性培养基或特异性引物/探针的设计至关重要。
  2. 受损菌株（Viable But Non-Culturable, VBNC）的检测： 经历生产压力（如冻干、高温）后的益生菌可能进入 VBNC 状态，在标准培养条件下无法形成菌落，导致平板计数法低估活菌数。流式细胞术结合活性染料或分子生物学方法（如结合核酸染料的 PMA-qPCR）有助于更全面地评估活菌。
  3. 产品基质的干扰： 复杂的基质成分（如油脂、蛋白质、膳食纤维、矿物质、包埋材料）可能抑制菌体复苏生长、干扰染色效果或抑制 PCR 反应。优化样品前处理（如稀释、过滤、离心、添加中和剂）是克服干扰的关键。
  4. 操作人员技能： 稀释、涂布、无菌操作等步骤需要熟练、规范的操作，否则会引入显著误差。严格的培训和考核是保证结果可靠性的基础。
  5. 标准物质与质控： 使用有证标准物质或经确认的参考菌株进行日常质控至关重要。每次检测应包含空白对照、阳性对照（已知浓度的目标菌株）以及可能的内标。
  6. 稳定性考量： 益生菌载量会随时间衰减。验证结果仅代表检测时的状态。建立货架期研究（稳定性试验）以监控整个保质期内的活菌数变化是产品开发的重要部分。
 

四、 质量控制与合规性

  • 建立严格的质量标准： 设定合理的可接受标准（如载量范围、RSD 要求）。
  • 实施内部质量控制 (IQC)： 日常检测中纳入标准物质、平行样、空白样等。
  • 定期参加能力验证 (PT) 或实验室间比对 (ILC)： 评估实验室检测能力和结果的准确性。
  • 遵守良好实验室规范 (GLP)： 确保实验数据的完整性、可追溯性和可靠性。
  • 符合法规要求： 遵循国家或地区的相关法规和标准（如中国《食品安全国家标准 食品微生物学检验》、美国 FDA 相关指南、ISO 标准如 ISO 19344 | IDF 232 等）。
 

五、 总结

益生菌载量验证是确保益生菌产品质量、功效和合规性的基石。它是一个涉及多学科知识（微生物学、分析化学、分子生物学）和严谨实验操作的复杂过程。通过科学选择验证方法、严格执行验证流程、克服关键挑战并建立完善的质量控制体系，才能获得准确、可靠的益生菌活菌数数据，为消费者提供安全有效的益生菌产品，并推动行业的健康发展。持续关注新技术（如快速检测、单细胞分析）的发展和应用，将有助于进一步提升益生菌载量验证的效率和准确性。