喷雾干燥存活率测定 - 中析研究所生物检测中心

喷雾干燥微生物存活率测定标准化流程

摘要： 本指南详细阐述了喷雾干燥过程中微生物（如益生菌、酵母、酶制剂生产菌株等）存活率测定的标准方法流程，涵盖样品前处理、干燥操作、存活率检测及数据分析等关键环节，旨在为科研与工业实践提供可重复、可比对的测定依据。

一、引言

喷雾干燥是食品、制药及生物技术领域将液态物料（如菌悬液、发酵液、含菌保护剂溶液）转化为干燥粉末的关键技术。该过程涉及高温、脱水等应力，对微生物活性构成显著挑战。准确测定喷雾干燥后微生物的存活率，对于评估干燥工艺效果、优化保护剂配方、保障终产品（如益生菌粉、发酵剂、酶制剂）的活性至关重要。本指南提供一套标准化测定方法。

二、实验材料与方法

2.1 样品制备

菌种与培养： 使用目标微生物标准菌株或生产菌株。按标准操作规程进行活化、扩大培养（如摇瓶发酵、发酵罐培养），确保培养物处于稳定期或所需生理状态。记录培养基成分、培养温度、时间、pH值等关键参数。
菌体收集与悬浮：
- 离心法：适度离心（避免高转速造成机械损伤）收集菌体，用无菌生理盐水或缓冲液（如磷酸盐缓冲液PBS）洗涤1-3次，去除培养基残留。
- 膜过滤法（可选）：适用于易受损菌体或小规模样品。
- 最终将菌体重悬于预先配制好的无菌保护剂溶液（如脱脂乳、麦芽糊精、海藻糖、甘油等单一或复合物）中，形成均匀菌悬液。记录初始菌悬液体积、保护剂类型与浓度。
- 初始活菌计数 (CFU/ml)： 对重悬后的菌悬液进行梯度稀释（通常10倍系列稀释），选择合适的培养基进行平板计数（倾注法或涂布法），每个稀释度做2-3个平行。记录培养条件（温度、时间、需氧/厌氧）。

2.2 喷雾干燥操作

设备设置： 根据实验目的设置喷雾干燥机关键参数：
- 进口温度 (T_in)：依据物料热敏性设定（如50°C - 180°C，常用范围60°C-120°C）。
- 出口温度 (T_out)：反映实际物料受热温度，是重要监测指标。
- 进料速率 (FR)：影响物料在干燥塔内的停留时间。
- 雾化器类型及参数（如压缩空气流量、压力或离心盘转速）。
- 进风流量 (AF)。
- 记录所有设定参数及实时监测值。
干燥过程：
- 将菌悬液置于进料罐，开启蠕动泵以设定流速进料。
- 开启加热系统、风机、雾化器，待T_in和T_out稳定后开始收集干燥粉末。
- 使用无菌容器在旋风分离器或布袋除尘器出口处收集干燥粉末样品。
- 记录干燥总时间、收集的粉末总质量。
粉末处理： 收集的粉末需立即转移至干燥、无菌、避光的密闭容器中（如带干燥剂的铝箔袋或棕色玻璃瓶）。通常建议在低温（如4°C）或冷冻干燥条件下短期储存（避免长期储存导致活性变化）。记录储存条件。

2.3 干燥后存活率测定

样品复溶： 准确称取一定质量 (m_powder, g) 的干燥粉末，加入适量无菌复溶液（通常为生理盐水、PBS或与保护剂兼容的缓冲液）。剧烈涡旋震荡或使用均质器（如Stomacher）充分混匀，确保粉末完全溶解/分散，形成复溶液。记录加入的复溶液体积 (V_recon, ml)。
梯度稀释： 对复溶液进行10倍系列稀释（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, ...），根据预估存活率选择合适的稀释度。
平板计数：
- 选择与初始计数相同的培养基和培养条件。
- 采用倾注法或涂布法进行平板接种。每个选定稀释度做2-3个平行平板。
- 在适宜温度下培养规定时间（通常24-72小时）。
- 计数具有目标微生物典型形态的菌落（CFU）。记录每个有效平板的菌落数。
存活率计算：
- 干燥后活菌浓度 (CFU/g 粉末)：
  N_dry = (CFU_count * Dilution_factor) / (V_plated * (m_powder / V_recon))
  - CFU_count: 有效平板的平均菌落数
  - Dilution_factor: 该平板对应的稀释倍数（如10⁻³稀释度则为1000）
  - V_plated: 接种到平板的液体体积 (ml)
  - m_powder: 用于复溶的粉末质量 (g)
  - V_recon: 加入的复溶液体积 (ml)
- 存活率 (SR, %)：
  SR (%) = (N_dry / N_initial) * 100
  - N_initial: 初始菌悬液的活菌浓度 (CFU/ml)，由2.1步骤测得。
  - 注意： N_initial 是菌悬液单位体积的活菌数，而 N_dry 是粉末单位质量的活菌数。计算存活率时，N_initial 需根据喷雾干燥前菌悬液的总活菌数和干燥后粉末总质量进行等效换算，或确保两者单位可比（通常最终结果以单位质量粉末中的活菌数占初始单位质量物料（折算）的百分比表示）。更严谨的计算需考虑进料体积 (V_feed, ml)、初始菌悬液活菌浓度 (N_initial, CFU/ml)、粉末总质量 (M_total, g)：
    N_dry_total = N_dry * M_total
    N_initial_total = N_initial * V_feed
    SR (%) = (N_dry_total / N_initial_total) * 100 = (N_dry * M_total) / (N_initial * V_feed) * 100
  - 实际报告中，SR (%) 和 N_dry (CFU/g) 通常都需要报告。

2.4 数据处理与报告

数据记录： 详细记录所有原始数据：初始菌悬液活菌数、干燥参数设定值与实测值、粉末质量、复溶体积、稀释梯度、平板计数结果。
统计分析：
- 计算每个样品（平行）的 N_dry 和 SR(%)。
- 计算平均值 (Mean) 和标准偏差 (SD) 或标准误 (SEM)。
- 建议进行至少3次独立实验（生物学重复），报告平均值±SD/SEM。
- 可使用统计软件（如SPSS, R）进行显著性差异分析（如t检验, ANOVA）。
结果报告内容：
- 目标微生物信息（菌种、菌株号）。
- 保护剂配方及浓度。
- 初始菌悬液活菌浓度 (N_initial)。
- 喷雾干燥关键参数 (T_in, T_out, FR, AF, 雾化方式等)。
- 干燥后粉末的活菌浓度 (N_dry, CFU/g)。
- 存活率 (SR, %)。
- 统计数据（平均值±SD/SEM, n值）。
- 所用培养基及培养条件。
- 任何可能影响结果的特殊操作或现象。

三、关键控制点与注意事项

代表性取样： 确保初始菌悬液混合均匀，干燥后粉末多点取样混合，保证样品代表性。
无菌操作： 整个流程（离心、洗涤、重悬、复溶、稀释、倒平板）需在无菌条件下进行，避免污染。
避免二次损伤： 离心速度不宜过高；复溶时避免剧烈操作（如高速均质）；选择温和的复溶液。
菌体复苏： 某些微生物干燥后存在“损伤”状态，可能需要特定的复苏条件（如特定培养基、预培养）。若需考虑损伤菌，可增加复苏步骤或使用选择性/非选择性培养基对比。
培养基与培养条件： 必须确保培养基和培养条件能支持目标微生物的良好生长和菌落形成。对厌氧菌需提供厌氧环境。
稀释误差： 使用精确移液器和无菌稀释管/瓶，避免稀释误差累积。确保充分混匀。
平板计数范围： 选择菌落数在30-300 CFU/平板的稀释度进行计数。低于30则计数所有菌落并注明，高于300则记录为“TMTC”（Too Many To Count），应选择更高稀释度重做。
水分影响： 高水分含量可能影响粉末中菌的稳定性，报告时可注明粉末水分含量（需另测）。
时效性： 干燥后粉末应尽快进行存活率测定，或在明确且一致的储存条件下短期保存后测定，并在报告中注明测定时间点。

四、结果解读与应用

工艺评估： 存活率是评价喷雾干燥工艺温和性的核心指标。通过比较不同 T_in, T_out, FR, AF, 保护剂配方下的存活率，可优化工艺参数。
保护剂筛选： 不同保护剂对特定微生物的保护效果差异显著。存活率测定是筛选高效保护剂组合的关键手段。
产品质量控制： 对于益生菌粉、发酵剂等产品，N_dry (CFU/g) 是核心质量指标，直接关系到产品功效。存活率则反映了生产过程的效率。
稳定性预测： 初始存活率高的产品，通常具有更好的储存稳定性潜力（需结合加速或长期稳定性试验验证）。