qPCR定量检测

发布时间：2025-07-03 10:27:42 阅读量：5 作者：生物检测中心

qPCR定量检测：原理、应用与标准化流程

一、 技术原理

实时荧光定量PCR (Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qPCR) 是一种在PCR反应过程中实时监测荧光信号变化，从而对起始模板核酸(DNA或cDNA)进行精确定量的分子生物学技术。其核心在于利用荧光标记物来追踪扩增产物的积累。

  • 荧光产生机制：
    • DNA结合染料法(如SYBR Green I)： 染料特异性地嵌入双链DNA(dsDNA)的小沟中，在激发光照射下发出荧光。荧光强度与反应体系中dsDNA的总量成正比。
    • 荧光探针法(如TaqMan探针)： 使用序列特异性的寡核苷酸探针，其5'端标记报告荧光基团(Reporter, R)，3'端标记淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整时，Q吸收R发出的荧光(FRET效应)。PCR延伸时，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性水解探针，使R与Q分离，R发出荧光。每扩增一个产物分子，就释放一个荧光信号。
  • 定量基础 - 扩增曲线与Ct值：
    • 扩增过程产生一条S型扩增曲线，分为基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。
    • Ct值 (循环阈值, Threshold Cycle)： 指PCR扩增过程中，产物的荧光信号首次达到设定阈值(Threshold)时所经历的循环数。Ct值与起始模板量成负相关关系：起始模板量越高，达到荧光阈值所需的循环数越少(Ct值越小)；反之亦然。
    • 标准曲线法(绝对定量)： 使用已知精确浓度的标准品(如质粒DNA、体外转录RNA)进行梯度稀释并同时扩增，建立Ct值与起始模板拷贝数对数(lg)之间的标准曲线(线性方程：Ct = -k * lg(起始量) + b)。通过待测样品的Ct值代入方程，即可计算出其绝对拷贝数。
    • 相对定量(如ΔΔCt法)： 常用于比较不同处理条件下目标基因表达量的差异。需要选择稳定的内参基因(Reference Gene/Housekeeping Gene) 进行校正。计算待测样品与内参基因的Ct差值(ΔCt = Ct_target - Ct_ref)，再计算处理组与对照组ΔCt的差值(ΔΔCt = ΔCt_treated - ΔCt_control)。目标基因的相对表达量通常表示为 2^(-ΔΔCt)。
 

二、 主要应用领域

  1. 基因表达分析： 研究不同组织、发育阶段、疾病状态或药物处理下特定基因mRNA的表达水平变化(需先将mRNA逆转录为cDNA)。
  2. 病原体检测与定量： 快速、灵敏、特异地检测和定量病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原体核酸载量，用于疾病诊断、疗效监测和流行病学调查(如HIV病毒载量、COVID-19核酸检测)。
  3. 转基因成分检测： 定量检测食品、饲料或环境样品中转基因生物(GMO)成分的含量。
  4. SNP分型与突变检测： 结合特异性探针设计(如等位基因特异性探针)，可用于单核苷酸多态性(SNP)分型和点突变的检测。
  5. microRNA分析： 通过特殊设计的引物(如茎环引物)或探针，定量检测microRNA等小RNA分子。
  6. 基因拷贝数变异(CNV)分析： 通过相对定量方法，检测基因组特定区域的拷贝数增加或缺失。
 

三、 标准化操作流程与关键点

  1. 样品准备：

    • 核酸提取： 使用合适的试剂或方法(如柱提法、磁珠法)从样品(细胞、组织、血液、体液、环境样本等)中提取高质量的总DNA或RNA。
    • RNA样品处理： 进行基因组DNA去除(gDNA Eraser)步骤。逆转录(RT)： 使用逆转录酶和引物(随机引物、Oligo dT或基因特异性引物)将mRNA合成cDNA。此步对基因表达定量至关重要。
    • 质量评估： 使用分光光度计或荧光计测定核酸浓度和纯度(OD260/OD280, OD260/OD230)，必要时进行琼脂糖凝胶电泳检测完整性。

  2. 反应体系配置：

    • 核心组分： PCR缓冲液(含Mg2+)、dNTPs混合物、热稳定DNA聚合酶(通常具有5'→3'外切酶活性，如Taq酶)、引物(正向和反向引物，需优化浓度)、荧光报告系统(DNA结合染料或荧光探针)、模板(DNA或cDNA)。
    • 引物/探针设计： 至关重要！引物应特异性强、避免二聚体及发卡结构，Tm值适宜且匹配。探针设计需位于上下游引物之间，Tm值通常比引物高5-10°C。设计后需通过BLAST验证特异性。
    • 优化： 通常需要优化引物浓度、退火温度、Mg2+浓度等。建议进行梯度实验。
    • 加样： 在洁净环境(最好在超净工作台或带紫外灭菌的PCR操作台)中进行，使用无核酸酶的枪头和离心管。推荐设置复孔(通常≥3个技术重复)以减少误差。严格设立对照！
      • 阴性对照(NTC)： 以无核酸水代替模板，监测试剂污染和引物二聚体。
      • 阳性对照(PTC)： 包含已知量的目标序列，监测反应体系有效性。
      • 无逆转录对照(-RT, 对RT-qPCR)： 在RNA样品中不加逆转录酶，用于监测基因组DNA残留污染。

  3. qPCR程序运行：

    • 将反应板/管放入荧光定量PCR仪中。
    • 设置程序：
      • 初始变性： 95°C, 2-10分钟 (激活热启动酶并彻底变性模板)。
      • 循环阶段(40-50个循环)：
        • 变性： 95°C, 10-30秒。
        • 退火： 引物/探针特异性结合，温度由引物Tm值决定(通常55-65°C)，15-30秒。
        • 延伸/荧光采集： 72°C (或酶的最适温度如60°C)，20-60秒。在退火或延伸步骤采集荧光信号（具体步骤取决于仪器和试剂要求）。
      • (可选)熔解曲线分析(Melting Curve)： 程序结束后，缓慢升温(如从60°C升到95°C，每升高0.5-1°C采集一次荧光)，绘制荧光强度随温度变化曲线(-dF/dT曲线)。用于染料法检测扩增产物特异性(单一主峰)或探针法验证。

  4. 数据分析：

    • 设定阈值(Threshold)： 通常设置在扩增曲线指数增长期的早期，高于背景荧光且明显高于NTC信号的位置。仪器软件通常提供自动或手动设置选项。
    • 获取Ct值： 软件根据设定的阈值自动计算每个反应孔的Ct值。
    • 质控判断：
      • NTC应无扩增或Ct值极大(如>38或未检出)。
      • PTC应在预期范围内。
      • -RT对照应无扩增或Ct值远大于对应的RT样品(差值通常>5)。
      • 复孔Ct值应接近(标准差SD通常<0.5)。
      • 染料法需检查熔解曲线是否为单峰且Tm值符合预期。
    • 定量计算：
      • 绝对定量： 根据标准曲线方程计算未知样品的拷贝数/浓度。注意稀释倍数。
      • 相对定量(ΔΔCt法)：
        1. 计算每个样品目标基因Ct值与内参基因Ct值的差值：ΔCt_sample = Ct_target - Ct_ref
        2. 计算处理组相对于对照组的ΔCt差值：ΔΔCt = ΔCt_treated_group - ΔCt_control_group (对照组平均ΔCt)
        3. 计算相对表达量：Fold Change = 2^(-ΔΔCt)
    • 结果报告： 清晰报告计算方法、所用内参基因、统计分析方法(如t检验、ANOVA)及显著性水平(p值)。
 

四、 关键注意事项

  • 污染控制： qPCR极其灵敏，严防污染是成功的关键。措施包括：严格分区(试剂准备区、样品处理区、扩增区)、使用带滤芯枪头、勤换手套、实验台面及仪器定期用稀释漂白水或DNA去除剂擦拭、紫外照射、独立移液器、避免气溶胶产生等。
  • RNA操作要求： RNA极易被RNase降解，操作需在无RNase环境下进行，使用无RNase的试剂和耗材，戴手套，避免说话，冰上操作。
  • 引物/探针特异性验证： 设计后务必进行BLAST比对，并通过实验验证(如电泳、测序、熔解曲线)。
  • 内参基因选择： 相对定量中，内参基因必须在所有实验条件下表达稳定。需通过实验验证其稳定性(如geNorm, NormFinder软件分析)。
  • 反应效率评估： 标准曲线斜率应在-3.1到-3.6之间(理论值-3.32)，对应扩增效率在90%-110%之间。效率不佳会影响定量准确性。
  • 模板质量与量： 低质量或降解的核酸、过高或过低的模板量都会影响结果。确保模板纯度好(A260/A280≈1.8-2.0, A260/A230>2.0)，并处于最佳检测范围内。
  • 仪器校准与维护： 定期对qPCR仪进行光学校准(R.O.X.或类似染料校准)，确保孔间均一性。
 

五、 优势与局限

  • 优势：
    • 高灵敏度：可检测极低拷贝数的模板。
    • 宽动态范围：可跨越多个数量级(通常可达7-8个log)进行定量。
    • 高特异性：通过探针或熔解曲线确保扩增产物正确。
    • 高通量：可同时检测大量样品。
    • 快速：通常2小时左右完成。
    • 定量准确：在优化条件下，结果可靠。
  • 局限：
    • 对抑制剂敏感：样品中的杂质可能抑制反应，需纯化。
    • 引物/探针设计要求高：设计不当会导致非特异扩增或效率低下。
    • 设备及试剂成本较高。
    • 仅能检测已知序列。
    • 绝对定量依赖于标准品的准确性和可比性。
 

六、 总结

qPCR凭借其高灵敏度、特异性、定量能力及相对便捷的操作，已成为现代分子生物学和医学诊断领域不可或缺的核心技术。其应用范围广泛，从基础研究到临床诊断都发挥着重要作用。然而，获得准确可靠的结果依赖于对原理的深刻理解、严谨的实验设计、规范的操作流程(特别是严格的污染控制和对照设置)、高质量的试剂以及精确的数据分析。随着技术的不断发展(如数字PCR的出现)，qPCR仍将在生命科学研究和应用中占据重要地位。