乳酸杆菌计数

乳酸杆菌计数：原理、方法与应用指南

乳酸杆菌因其在食品发酵、益生制品和肠道健康中的关键作用，其准确计数至关重要。以下是基于通用原理和方法的详细计数技术指南：

一、核心计数技术详解

1. 平板涂布法

   • 原理： 梯度稀释样品，使微生物在固体培养基表面分散成单个细胞，培养后形成肉眼可见的菌落（CFU）。
   • 步骤：
     • 样品制备： 无菌称取样品，加入适宜稀释液（如0.85%生理盐水或缓冲蛋白胨水），均质制成初始悬液。
     • 梯度稀释： 按10倍梯度（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…）逐级稀释样品悬液。每次稀释需充分混匀并使用无菌吸管/枪头。
     • 接种涂布： 选取2-3个适宜稀释度，吸取0.1ml或1ml稀释液（通常选0.1ml）于固体培养基平板中央。用无菌涂布棒均匀涂布整个表面。
     • 培养： 平板倒置，置于适宜该乳酸杆菌的厌氧环境（如厌氧罐或培养箱）中，在特定温度（常见37°C）下培养规定时间（通常24-72小时）。
     • 计数： 选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数。计算乳酸杆菌浓度：
       • 乳酸杆菌浓度 (CFU/g 或 CFU/ml) = 平均菌落数 × 稀释倍数 × 接种体积倒数
       • (例：平均80个菌落，稀释度10⁻⁵，接种体积0.1ml：CFU/ml = 80 × 10⁵ × 10 = 8.0 × 10⁷)

2. 倾注平板法

   • 原理： 梯度稀释样品后，将稀释液与融化并冷却的琼脂培养基混合，凝固后菌体在培养基内部形成菌落。
   • 步骤：
     • 样品制备与稀释同涂布法。
     • 混合培养： 取1ml适宜稀释液加入无菌培养皿。迅速倒入融化并冷却至约45°C的琼脂培养基（约15-20ml），立即轻轻旋转混匀。
     • 凝固与培养： 待琼脂凝固，倒置平板，按涂布法条件进行厌氧培养。
     • 计数： 选择菌落数在25-250 CFU之间的平板计数（乳酸杆菌在琼脂内部生长，菌落较小）。计算方法同涂布法。

3. 最可能数法

   • 原理： 统计学方法，基于微生物在系列稀释管中生长的概率分布估算原始浓度。
   • 步骤：
     • 梯度稀释： 制备比平板法更大的梯度稀释系列（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵）。
     • 液体培养： 每个稀释度接种多个（通常3或5管）装有乳酸杆菌专用液体培养基（如MRS肉汤）的试管。
     • 培养观察： 厌氧培养适宜时间后，观察各管浑浊度或产酸（指示剂变色）判断生长（阳性管）。
     • 查表计算： 根据各稀释度阳性管数组合，查MPN统计表获得最可能数及其置信区间。最终浓度表示为 MPN/g 或 MPN/ml。

4. 滤膜法

   • 原理： 适用于低菌量样品（如水质）。样品通过无菌滤膜（孔径≤0.45μm）截留细菌，将滤膜贴于固体培养基培养。
   • 步骤：
     • 一定体积样品经滤膜过滤。
     • 无菌操作将滤膜转移至乳酸杆菌专用固体平板表面（保证良好接触）。
     • 按涂布法条件进行厌氧培养。
     • 计数滤膜上的菌落数，计算浓度：CFU/体积样本 = 菌落数 / 过滤样本体积。

二、关键要素与注意事项

1. 培养基选择：

   • 必需特性： 支持乳酸杆菌生长、抑制杂菌（如添加抗生素、乙酸钠、低pH）。
   • 常用类型： 改良MRS琼脂、APT琼脂等是常用基础培养基，添加特定组分或调节pH可提高选择性。

2. 培养条件：

   • 厌氧环境： 多数乳酸杆菌严格或兼性厌氧。常用方法包括：
     • 厌氧罐/盒： 利用产气袋（产生CO₂和H₂）和钯催化剂（消耗O₂）创造无氧环境。
     • 厌氧工作站： 提供持续稳定的厌氧环境（惰性气体氛围）。
   • 温度与时间： 根据目标菌种设定（常用37°C，48-72小时）。

3. 菌落识别：

   • 典型特征： 微小（1-2mm）、圆形、光滑凸起、边缘整齐、乳白/奶油色菌落。
   • 确认试验（必要时）： 革兰氏染色（G⁺杆菌）、过氧化氢酶试验（阴性）、接触酶试验（通常阴性）。

4. 样品处理要点：

   • 均质： 确保菌体充分分散。固体样品需强力均质器。
   • 稀释液： 维持渗透压(pH稳定)，常用生理盐水或缓冲液（如磷酸盐缓冲液、蛋白胨水）。
   • 时效性： 尽快处理分析，尤其含活菌产品。
   • 无菌操作： 全过程严格无菌，防止污染导致结果偏差。

5. 方法选择依据：

   • 平板法（涂布/倾注）： 首选直接计数法，结果直观（CFU），适用于多数样品。
   • MPN法： 适用于含颗粒、易聚集样品或低菌量样品，结果为统计学估算（MPN），精度低于平板法。
   • 滤膜法： 专为低浓度液体样品（如水、饮料）设计。

三、结果报告规范

• 清晰标注：
  • 使用的方法（如平板涂布法）
  • 使用的培养基（如改良MRS琼脂）
  • 培养条件（如37°C厌氧培养48小时）
  • 结果单位（如CFU/g, CFU/ml, MPN/g）
  • 报告稀释度（可选）
• 科学修约： 通常报告2位有效数字（如 1.5 × 10⁸ CFU/g）。
• 特殊情况说明： 如样品稀释度高且无菌落生长，报告 < 最低检测限值（如 < 10 CFU/g）。

四、应用场景

• 食品行业： 监测发酵食品（酸奶、泡菜、香肠）菌种活力、发酵进程及保质期活菌量。
• 益生菌制品： 评估产品中活乳酸杆菌含量是否符合标签宣称或标准要求。
• 科研领域： 研究乳酸菌生理特性、发酵动力学或菌株筛选。
• 环境监测： 分析特定环境（如发酵车间）中乳酸菌分布。
• 临床/微生物学： 定量特定样本（如粪便）中乳酸菌群。

五、提升准确性要点

1. 充分混匀： 均质及每一步稀释需彻底混匀。
2. 梯度合理： 根据预估菌量选择合适起始稀释度和梯度范围。
3. 平行试验： 每个稀释度至少做两个平行平板/管。
4. 及时计数： 防止蔓延菌落干扰计数。
5. 定期校准： 确保移液器、培养箱等设备精确性。
6. 人员培训： 操作者需熟练掌握无菌技术与计数技巧。

结论

准确计数乳酸杆菌是保障产品质量、评估益生效果及开展科学研究的基础。掌握平板涂布法、倾注法、MPN法和滤膜法的原理及操作细节，严格把控培养基选择、培养条件（尤其是厌氧环境）、样品处理和结果报告等关键环节，并结合规范操作与质量控制措施，方能获得可靠的实验结果。根据样品特性和检测目的选择最适宜的方法是确保计数成功的核心要素。