冻干预处理活菌数测定技术指南
摘要： 冻干技术是长期保藏微生物菌种的关键方法。准确测定冻干菌粉中的活菌数量，对于评估其活力、稳定性及后续应用效果至关重要。本指南详述了冻干菌粉复苏及活菌计数的标准操作流程，确保结果准确可靠。
一、 目的
规范冻干微生物菌粉在活菌计数前的预处理（复苏）步骤及平板计数法操作，获得具有代表性的活菌总数（CFU/g或CFU/mL）。
二、 基本原理
冻干过程使微生物细胞脱水休眠。测定前需通过特定复水介质和温度，使休眠细胞恢复代谢活性。随后采用标准倾注平板法或涂布平板法，利用适宜培养基培养，计数形成的可见菌落（CFU），计算单位样品中的活菌浓度。
三、 材料与设备
- 样品： 待测冻干菌粉。
- 稀释液： 无菌生理盐水（0.85-0.90% NaCl）、磷酸盐缓冲液（PBS，0.1M, pH 7.2 ± 0.2）或其他经确认对目标菌无抑制、无促进生长的无菌稀释液。使用前预热至规定温度（通常40-45°C）。
- 复苏/复水介质： 根据目标微生物特性选择：
- 特定液体培养基（如MRS肉汤用于乳酸菌）
- 含还原剂培养基（如含半胱氨酸的培养基用于严格厌氧菌）
- 无菌脱脂牛奶溶液（如10%，w/v）
- 专用复苏液（需说明成分或依据）
- 培养基： 适合目标微生物生长、形成可辨菌落的固体培养基（如MRS琼脂、营养琼脂、特定选择性/鉴别培养基）。配制后灭菌，冷却至45-50°C备用。
- 设备：
- 恒温水浴锅（控温精度±1°C）
- 无菌均质器或旋涡混合器
- 无菌天平（精度0.001g）
- 无菌吸管（1mL, 10mL）或移液器及无菌吸头
- 无菌培养皿（直径90mm）
- 无菌稀释瓶（带玻璃珠）或试管
- 菌落计数器或放大镜
- 恒温培养箱（设定温度依菌种而定）
- 无菌操作台（生物安全柜或超净工作台）
- 计时器
- 温度计
四、 操作步骤
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准备工作：
- 清洁工作区，开启无菌操作台，紫外灭菌至少30分钟。
- 预热水浴锅至目标复苏温度（通常40-45°C）。
- 将所需体积的预选复水介质置于无菌试管中，放入水浴锅平衡至目标温度（如45°C）至少15分钟。记录介质类型。
- 预热足量无菌稀释液至规定温度（通常40-45°C）。
- 准备足量无菌培养皿、吸管/吸头、稀释瓶/试管。
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样品称取与初步混匀（无菌操作）：
- 在无菌操作台内，用无菌药匙或刮刀轻轻搅拌冻干菌粉，使其疏松均匀（避免剧烈动作产生气溶胶）。
- 用无菌天平准确称取规定量（如1.000g）冻干菌粉样品，置于含有预热至45°C的复水介质（如10mL）的无菌容器（如带玻璃珠的稀释瓶）中。
- 立即盖紧瓶盖。
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复苏（复水活化）：
- 将装有样品和复水介质的容器迅速放入预热至45°C的恒温水浴锅中。
- 启动计时器，开始复苏。期间可轻柔摇动或置于旋涡混合器上短暂混合（如5-10秒）数次（如每5分钟一次），确保样品充分悬浮和复水。严格记录复苏介质类型、温度和时间（如：45°C，无菌脱脂牛奶溶液，15分钟）。
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初始悬浮液制备：
- 复苏结束后，立即将容器从水浴锅中取出。
- 在无菌操作台内，用预热至45°C的无菌稀释液将复水后的样品定容至预设体积（如100mL），得到初始悬浮液（10⁻¹或10⁰ g/mL）。
- 剧烈振摇（带玻璃珠的瓶子）或使用无菌均质器（按安全规程操作）混匀1-2分钟，确保菌体充分分散。此即为“10⁰”稀释度。
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梯度稀释：
- 准备一系列（通常6-9支）含9mL预热无菌稀释液的无菌试管或稀释瓶（如10mL规格），标记为10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ ...。
- 用无菌吸管或移液器吸取1mL初始悬浮液（10⁰），加入第一支含9mL稀释液的试管中，即为10⁻¹稀释度。盖紧，在旋涡混合器上剧烈振荡混匀约30秒。
- 更换吸头，从10⁻¹稀释度吸取1mL加入下一支含9mL稀释液的试管中，混匀，得到10⁻²稀释度。
- 依此类推，进行连续10倍梯度稀释，直至达到预期低稀释度（通常选择能长出30-300 CFU/皿的稀释度）。每步稀释必须更换无菌吸头/吸管，并充分混匀。
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倾注平板：
- 选择2-3个预期菌落数在30-300 CFU/皿之间的适宜稀释度（如10⁻⁶, 10⁻⁷, 10⁻⁸）。
- 用无菌吸管或移液器分别吸取1mL各选定稀释度的菌悬液，注入对应标记的无菌培养皿中央。
- 立即向每个培养皿倾注约15-20mL已冷却至45-50°C的融化固体培养基。
- 迅速在无菌台面上水平旋转培养皿6-8次，使菌悬液与培养基充分混匀。避免产生气泡。
- 静置台面，待琼脂完全凝固（约10-15分钟）。必要时可倒置放置加速凝固。
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培养：
- 待平板凝固后，倒置放入设定好温度的恒温培养箱中。
- 按目标微生物要求进行培养（如乳酸菌于37°C厌氧培养48-72小时；好氧菌于30-37°C培养24-48小时）。记录培养温度和时间。
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菌落计数：
- 培养结束后，取出平板。
- 选择菌落形态典型、分散良好、数量在30-300 CFU之间的平板进行计数。若所有稀释度均不在该范围，则计数最接近30-300 CFU范围的平板（如<30则计实际数并注明，>300则计为“TNTC”）。
- 使用菌落计数器或放大镜进行人工计数。注意区分目标菌落与可能的污染菌落。
- 每个稀释度至少计数两个平行平板。
- 记录每个计数平板的稀释度、菌落数及菌落形态特征。
五、 结果计算
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计算每个有效稀释度下的平均菌落数：
- 同一稀释度的两个平行平板菌落数相差小于15%时，取其算术平均值。
- 若相差大于15%，需检查原因，必要时重做。
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计算每克（或毫升）冻干样品中的活菌数（CFU/g或CFU/mL）：
活菌数 (CFU/g或CFU/mL) = 平均菌落数 × 稀释倍数 × 1 / 接种体积(mL) × (1 / 样品质量(g) 或 体积(mL))- 稀释倍数： 所选用于计数的稀释度（如10⁻⁷稀释度的稀释倍数为10⁷）。
- 接种体积： 通常为1mL。
- 样品质量/体积： 最初称取的冻干粉质量（g）或体积（mL）。
- 示例： 称取1.000g冻干粉，用10mL复水介质复水，定容至100mL得初始液（10⁰）。吸取1mL初始液进行10倍系列稀释，在10⁻⁷稀释度（取1mL）倾注平板，培养后平均菌落数为85。
活菌数 (CFU/g) = 85 × 10⁷ × (1 / 1) × (1 / 1.000) = 8.5 × 10⁹ CFU/g - 结果通常用科学计数法表示（如8.5 × 10⁹ CFU/g），并注明复苏条件（如“经45°C无菌脱脂牛奶溶液复苏15分钟后测定”）。
六、 注意事项与质量控制
- 无菌操作： 全过程严格无菌操作是防止污染、保证结果准确的关键。
- 温度控制： 复水介质、稀释液温度及复苏水浴温度需精确控制并记录。温度过高或过低均影响复苏效果。
- 复苏关键： 复水介质成分、温度、时间对冻干菌的复苏效率有显著影响。需依据文献或预试验确定最佳条件并严格记录。
- 样品代表性： 冻干粉需充分混匀后再取样称量。
- 充分分散： 初始悬浮液和每一步稀释液必须充分振荡混匀，确保菌体均匀分散，避免成团。
- 稀释梯度： 选择合适的稀释梯度至关重要，确保有平板落在30-300 CFU的理想计数范围。
- 平行试验： 每个稀释度至少做两个平行平板。
- 菌落识别： 熟悉目标菌落的典型形态，必要时进行染色镜检或生化鉴定确认。
- 阴性对照： 应设置稀释液和培养基的阴性对照平板，确保无菌污染。
- 记录完整性： 详细记录所有操作细节：样品信息、称样量、复水介质类型/体积/温度/时间、稀释液类型/温度、稀释步骤、接种体积、培养基类型、培养条件（温度/时间/气氛）、计数结果、计算过程、操作人员、日期等。
- 重复性： 重要样品建议进行重复测定（至少两次独立实验）。
- 误差范围： 理解平板计数法本身存在约±0.3 log的固有误差。
七、 应用意义
准确测定冻干预处理后的活菌数，是评估以下方面的核心依据：
- 菌种保藏质量： 判断冻干工艺效果及菌种库存储状态。
- 产品效价： 益生菌制剂、发酵剂、微生物肥料/农药等产品的核心质量指标。
- 应用效果预测： 为发酵接种、环境修复、饲喂添加等应用提供剂量参考。
- 稳定性研究： 监测菌种在储存、运输过程中的活力变化。
结论：
遵循标准化的冻干预处理（复苏）和活菌计数流程，并实施严格的质量控制，是获得准确、可靠的冻干微生物活菌数数据的保障。明确记录的复苏条件对于结果解读和不同批次/不同来源样品间的比较具有决定性意义。该方法为微生物资源的有效管理和应用提供了重要的量化基础。
说明： 本指南提供通用框架，具体操作参数（如最佳复水介质、温度、时间、培养条件等）需根据目标微生物的具体种类、特性和相关标准文献进行优化和确认。