厌氧菌计数

厌氧菌计数：原理、方法与关键步骤详解

厌氧菌是一类只能在缺氧或极低氧分压环境中生长繁殖的微生物，广泛存在于自然环境（如土壤、水体沉积物、沼泽）及动物体内（如肠道、口腔、生殖道）。准确计数厌氧菌对于临床感染诊断、环境微生物研究、食品与药品安全监控、以及工业发酵过程控制等方面具有至关重要的意义。由于其对氧气的高度敏感性，厌氧菌计数面临独特挑战，需要严格的无氧操作技术和专门的培养方法。

一、 厌氧菌计数的核心挑战

1. 氧气敏感性： 这是最大挑战。暴露于空气（含约21%氧气）会导致大多数严格厌氧菌迅速死亡或失去可培养性。
2. 采样与运输： 从厌氧环境（如深部伤口、肠道内容物、厌氧反应器）采集样本时，必须立即隔绝空气并尽快在厌氧条件下处理，以防菌群组成发生变化或数量减少。
3. 培养要求： 需要专门的设备和技术在整个培养期间（通常数天至数周）维持严格的厌氧环境。
4. 生长缓慢： 许多厌氧菌生长速度相对较慢，计数所需培养时间较长。

二、 厌氧环境的创建与维持

成功计数厌氧菌的基础是创造并维持一个无氧环境，主要依赖以下设备和技术：

1. 厌氧工作站： 是目前最常用的设备。它是一个密封的透明箱体（手套箱），内部可通过持续通入混合气体（通常为N₂ 80-85%，H₂ 5-10%，CO₂ 5-10%）并利用内置催化剂去除残余氧气，达到并维持极低的氧浓度（<1 ppm）。操作者通过箱体上的手套在内部进行样本处理、稀释、倾注平板或涂布平板、培养和观察等全部操作。
2. 厌氧罐： 经济、灵活的选择。将接种好的培养基平板或液体培养基试管放入密封罐内。使用厌氧气袋生成系统（内含柠檬酸、碳酸氢钠和硼氢化钠等化学物质，加水后反应产生H₂和CO₂）或气体置换法（反复抽真空并用N₂或预混厌氧混合气填充数次）。罐内放置钯催化剂（常附着于颗粒或条状物上），在H₂存在下催化残余O₂与H₂反应生成水，最终营造厌氧环境。
3. 预还原厌氧灭菌培养基： 普通培养基在制备和灭菌过程中会溶解氧气。用于厌氧菌培养的培养基必须经过特殊处理：
   • 煮沸驱氧： 配制培养基时煮沸以驱除溶解氧。
   • 还原剂添加： 加入还原剂（如L-半胱氨酸盐酸盐、硫乙醇酸钠、二硫苏糖醇）以降低氧化还原电势（Eh），通常目标Eh需低于-150mV甚至更低（如-300mV）。刃天青（Resazurin）常作为氧化还原指示剂（粉红色表示有氧，无色表示厌氧）。
   • 厌氧分装与储存： 在无氧条件下（如持续通N₂）分装培养基到试管或瓶中，并密封保存。使用前再煮沸或置于厌氧环境平衡以除去储存期间可能渗入的微量氧。
4. 滚管技术： 一种经典方法。将熔化的琼脂培养基保持在约48°C水浴中，在持续通入无氧气体（如CO₂）条件下，用注射器将稀释好的样品注入装有培养基的厌氧试管中，迅速封口并滚动试管使其凝固在管壁上形成薄层。培养后菌落在管内壁形成。此法设备要求相对简单，但操作繁琐，计数相对困难。

三、 主要计数方法

1. 倾注平板法 / 涂布平板法：

   • 原理： 最常用的定量计数方法，基于活细胞在固体培养基上形成可见菌落的能力。
   • 步骤：
     1. 样本处理： 在厌氧环境下（工作站或持续通无氧气体的操作台）将样本制成均匀悬浮液。
     2. 梯度稀释： 用预还原的稀释液（如磷酸盐缓冲液、生理盐水或含0.05%半胱氨酸的盐溶液）进行十倍系列稀释。稀释过程需在厌氧环境下快速完成。
     3. 接种：
        • 倾注法： 取适量稀释液加入无菌平皿，迅速倒入预融化并冷却至约48°C的厌氧琼脂培养基，立即在厌氧环境下水平旋转混匀，凝固。
        • 涂布法： 取适量稀释液加至预凝固的厌氧琼脂平板表面，用无菌涂布棒均匀涂开（平板需预先在厌氧环境平衡）。
     4. 厌氧培养： 将接种好的平板迅速放入厌氧罐或厌氧工作站内，在适宜的厌氧环境（如N₂/H₂/CO₂混合气）及适宜温度（通常35-37°C）下倒置培养。培养时间通常需要5-7天或更长，具体取决于菌种。
     5. 菌落计数： 培养结束后，在厌氧环境下取出平板（工作站内计数或迅速转移计数），计数具有典型形态的菌落（如有必要可借助解剖镜）。选择菌落数在30-300之间的平板进行计算。
     6. 计算： 菌落形成单位 (Colony Forming Units, CFU) = 平均菌落数 × 稀释倍数 × 接种量校正因子（如涂布法10ul接种量则因子为100）。单位通常为 CFU/g (固体) 或 CFU/ml (液体)。
   • 优点： 结果直观，可同时进行菌落形态学观察和初步分纯。
   • 缺点： 耗时长（培养），可能低估数量（部分损伤细胞或需要特殊营养的菌无法生长成菌落），操作需在厌氧环境进行。

2. 液体培养基稀释法 / 最大可能数法：

   • 原理： 适用于计数生长缓慢或难以在平板上形成可见菌落的厌氧菌，或样本中菌量极低时。基于统计学原理，通过系列稀释样本至无菌生长，估算原始样本中的活菌数。
   • 步骤：
     1. 制备系列稀释管： 取多管（如5管或3管/稀释度）装有预还原厌氧液体培养基（如强化梭菌培养基、硫乙醇酸盐流体培养基等）的试管。
     2. 梯度稀释与接种： 在厌氧环境下，将样本进行十倍系列稀释，每个稀释度接种一定体积（如1ml）到相应的一组（如5管）培养基中。通常设置多个连续的稀释度。
     3. 厌氧培养： 密封试管（或置于厌氧罐中），在适宜温度下培养足够时间（可能数周）。
     4. 观察生长： 定期或培养结束时观察各管浊度、产气、沉淀等生长指示。
     5. 统计与计算： 记录每个稀释度出现阳性（生长）的试管数。查阅标准MPN统计表，根据各稀释度的阳性管数组合，得出样本中活菌的最大可能数（MPN）及95%置信区间。单位通常为 MPN/g 或 MPN/ml。
   • 优点： 能检测到在平板上不生长的菌，对低菌量样本敏感度高。
   • 缺点： 结果不够精确（是估值），耗时长（培养），工作量大（需多管重复），无法观察单个菌落特征。

3. 显微镜直接计数法：

   • 原理： 使用血细胞计数板或荧光染料在显微镜下直接计数样本中的所有细菌细胞（活菌+死菌）。
   • 步骤： 制备样品悬液，滴加到计数板上，在显微镜下计数特定区域的细胞数，进行计算。
   • 优点： 快速、直观。
   • 缺点： 无法区分活菌和死菌，对菌量低的样本误差大，对混杂杂质多的样本难以准确计数，对形态相似的菌群计数困难。此法不适用于厌氧菌活菌的定量，但可用于总菌数的快速粗略估计。

4. 分子生物学方法：

   • 原理： 基于检测细菌的特定基因（如16S rRNA基因）。
   • 定量PCR： 设计厌氧菌群或特定菌种的引物/探针，通过荧光信号的累积定量目标DNA的量。
   • 优点： 快速（数小时），灵敏度高，可检测不可培养的厌氧菌（VBNC状态或苛刻生长需求），可进行种属特异性定量。
   • 缺点： 区分活死菌需特殊处理（如叠氮溴化丙锭预处理），DNA提取效率、PCR扩增效率影响准确性，设备昂贵，操作技术要求高，结果反映的是基因拷贝数而非传统活菌数（CFU），两者关系复杂且受多种因素影响。
   • 应用： 更常用于研究厌氧菌群落结构（宏基因组学、16S测序）或特定病原体的快速诊断（如qPCR检测艰难梭菌毒素基因）。

四、 关键注意事项与质量控制

1. 严格厌氧操作： 从采样到培养结束，所有可能接触样本或培养基的操作步骤都必须在无氧条件下进行或尽可能缩短暴露时间。熟练掌握厌氧设备的操作规范至关重要。
2. 培养基选择与质量：
   • 选择适宜的厌氧基础培养基（如布鲁氏菌血琼脂、CDC厌氧血琼脂、强化梭菌培养基等）。
   • 根据需要添加特定生长因子（如维生素K、氯化血红素）、抗生素（抑制杂菌）或底物。
   • 使用前检查培养基的还原状态（刃天青应为无色）。
   • 进行无菌试验和生长性能试验（使用标准厌氧菌株）。
3. 样本的代表性与处理： 确保取样部位准确，样本充分混匀。固体样本需用匀浆器在厌氧环境下制成均匀悬液。稀释液需预还原并维持低温。
4. 稀释梯度： 根据预估的菌量设置足够宽泛的稀释梯度，确保有可计数的平板或出现无菌生长的稀释度（MPN法）。
5. 培养条件： 保持恒定的最佳培养温度和严格的厌氧环境。培养时间需足够长以满足慢生菌的需求。
6. 对照设置：
   • 阴性对照： 无菌稀释液或培养基接种后培养，确认无菌生长。
   • 阳性对照： 使用已知浓度的标准厌氧菌株（如产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌）接种培养基，验证培养基和培养条件支持生长。
   • 环境对照： 空白平板或液体培养基置于厌氧罐/工作站中培养，检查环境是否无菌污染。
7. 菌落识别： 厌氧菌菌落形态多样，需进行菌落特征描述（大小、形状、边缘、颜色、透明度、溶血性等）。必要时挑取单菌落进行革兰染色、镜检、生化鉴定或分子鉴定。
8. 记录与分析： 详细记录样本信息、稀释步骤、接种量、培养条件、菌落计数结果、对照结果等。准确计算并报告结果（CFU/g/ml 或 MPN/g/ml），标明使用的计数方法。

五、 应用价值

1. 临床诊断： 定量检测血液、脓液、组织、体液等临床样本中的厌氧菌，辅助诊断厌氧菌感染（如腹腔感染、盆腔炎、牙周脓肿、坏死性软组织感染），监测抗生素治疗效果。
2. 环境微生物学： 研究厌氧环境（如湿地、污泥、垃圾填埋场、深层地下环境）中的微生物群落丰度、多样性及功能，评估污染物厌氧降解效率。
3. 食品与发酵工业： 监控发酵食品（如奶酪、泡菜、酱油、啤酒）中的有益厌氧菌（如乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌）的数量与活力；检测食品中的腐败厌氧菌或致病厌氧菌（如肉毒梭菌、产气荚膜梭菌），保障食品安全；优化工业厌氧发酵过程（如沼气生产、生物制氢、有机酸生产）的菌群管理。
4. 药品与化妆品： 检测无菌产品或限菌产品是否符合厌氧菌的微生物限度标准。

六、 总结

厌氧菌计数是一项技术要求高且细致的工作，其核心在于克服氧气对目标菌的毒害作用。通过创建严格的厌氧环境（厌氧工作站、厌氧罐），使用预还原的无氧培养基，并选择合适的计数方法（倾注/涂布平板法、MPN法），可以获得可靠的活菌数量信息。随着技术进步，分子定量方法（如qPCR）提供了更快速灵敏的选择，但传统培养法仍是活菌定量的“金标准”和基础。严格的质控措施贯穿整个流程是保证计数结果准确可靠的关键。准确计数厌氧菌对于深入理解厌氧微生物生态、诊断和治疗相关疾病、保障产品质量安全具有重要意义。