平板菌落计数

平板菌落计数标准操作规程

原理简述：
平板菌落计数法（倾注法）通过系列稀释样品，使微生物在固体培养基上分散生长形成肉眼可见的独立菌落（CFU）。统计特定稀释度平板上适宜数量（30-300 CFU）的菌落数，乘以稀释倍数，计算原始样品中的微生物活菌总数（CFU/g或CFU/mL）。

一、 试剂与材料

1. 无菌稀释液： 磷酸盐缓冲液（PBS，0.85% NaCl + 磷酸盐，pH 7.2 ± 0.2）或生理盐水（0.85-0.90% NaCl）。
2. 无菌培养基： 营养琼脂（或根据检测目标微生物选择特定培养基）。
3. 无菌耗材：
   • 9 mL 灭菌稀释管
   • 90 mL 灭菌稀释瓶
   • 无菌吸管（1 mL、10 mL）或无菌移液器吸头
   • 无菌平皿（直径90mm）
   • 无菌均质袋及均质器（用于固体/半固体样品）
   • 无菌玻璃棒或涂抹棒
4. 其他： 恒温培养箱、菌落计数器（或放大镜、计数笔）、水浴锅（控温46±1℃）、标记笔、酒精灯、生物安全柜或无菌操作台。

二、 样品处理

1. 无菌取样： 严格无菌操作获取代表性样品。
2. 均质化：
   • 液体样品： 剧烈摇晃25次以上（幅度约30cm），确保混匀。
   • 固体/半固体样品： 称取25g样品置于无菌均质袋，加入225mL无菌稀释液（初次10倍稀释），用均质器充分均质（推荐8000-10000rpm，1-2分钟），形成1:10样品匀液。

三、 样品稀释与接种

1. 梯度稀释：
   • 取1:10样品匀液或液体样品1mL，加入9mL无菌稀释液中，混合均匀，得1:100稀释液。
   • 依上述方法，制备1:1000、1:10000等更高稀释度（通常需3个连续稀释度）。
   • 关键点： 每次转移至新稀释管时需更换无菌吸管/吸头，避免交叉污染；混匀采用涡旋或反复吹吸。
2. 倾注平板：
   • 选择2-3个适宜稀释度（预估产生30-300CFU）。
   • 方法一： 取1mL稀释液加入无菌平皿，迅速倾入约15-20mL预先熔化并冷却至46±1℃的琼脂培养基，立即轻柔旋动平皿使内容物充分混匀（避免溅起）。
   • 方法二： 先倾注15-20mL熔化琼脂入平皿，待其凝固。取1mL稀释液滴加于凝固琼脂表面，用无菌玻璃棒/涂抹棒均匀涂布（需保证稀释液被琼脂完全吸收）。
   • 空白对照： 每次实验应做空白对照（不加样品稀释液，仅倾注培养基）。
3. 凝固与标记： 待琼脂完全凝固后，翻转平皿（盖朝下），标记样品名称、稀释度、日期等信息。

四、 培养

• 将平皿倒置于恒温培养箱中培养。
• 典型条件： 需氧菌36±1℃培养48±2小时（或特定标准规定时间）。
• 关键点： 避免堆叠过多平皿影响热传导；设定温湿度监控。

五、 菌落计数

1. 选择适宜平板： 仅统计菌落数在30-300 CFU之间的平板（蔓延菌落处理见注意事项）。若所有平板均<30 CFU，则选最低稀释度平板计数；若均>300 CFU，选最高稀释度平板计数（注明“估计菌落数”）。
2. 计数规则：
   • 肉眼观察，使用菌落计数器辅助。
   • 计入： 所有肉眼可见菌落，包括针尖大小菌落（除非确认是杂质）。平皿边缘菌落（≥50%在计数区）。
   • 不计入： 蔓延菌落覆盖区域（见注意事项）、琼脂内部菌落（非目标）、明显杂质。
   • 蔓延菌落处理（ISO 4833等标准）：
     • 蔓延面积<平板面积1/4：计数其余部位菌落，计算蔓延菌落数（或按正常计数）。
     • 蔓延面积>1/4且非链状：报告“蔓延菌落覆盖”。
     • 链状菌落：视为单个菌落（无论是否蔓延）。
   • 双碟计数： 同一稀释度两个平板均应计数。
3. 记录： 清晰记录每个可计数平板的菌落数及对应稀释度。

六、 结果计算与报告

1. 计算公式：
   • 标准情况： N = ΣC / [(n1 + 0.1n2) * d]
     • N：样品中菌落总数 (CFU/g或CFU/mL)
     • ΣC：所有适宜平板（菌落数30-300）的菌落数之和
     • n1：低稀释度（菌落数在30-300）的平板数
     • n2：高稀释度（菌落数在30-300）的平板数
     • d：与n1对应的稀释度（如10⁻²，则d=0.01）
   • 示例： 稀释度10⁻²两平板菌落数：168, 215；稀释度10⁻³两平板菌落数：34, 28。则：
     • ΣC = 168 + 215 + 34 + 28 = 445
     • n1 = 2 (10⁻²平板), n2 = 2 (10⁻³平板)
     • d = 10⁻² = 0.01
     • N = 445 / [ (2 + 0.1*2) * 0.01 ] = 445 / [ (2 + 0.2) * 0.01 ] = 445 / (2.2 * 0.01) = 445 / 0.022 ≈ 20, 227 CFU/g(mL) ≈ 2.0 × 10⁴ CFU/g(mL)
   • 特殊情况：
     • 所有平板<30 CFU：计算最低稀释度平均值 × 稀释倍数，报告“估计菌落数”。
     • 所有平板>300 CFU：计算最高稀释度平均值 × 稀释倍数，报告“估计菌落数”。
     • 无法计数（如大量蔓延）：报告“平板菌落蔓延无法计数”。
     • 空白对照有菌：结果无效。
2. 报告：
   • 结果取两位有效数字（如15, 500报告为1.6 × 10⁴）。
   • 注明单位（CFU/g或CFU/mL）。
   • 报告检测方法依据（如参考GB 4789.2、ISO 4833等）。
   • 注明培养条件（温度、时间）。
   • 报告任何特殊情况（如估计值、蔓延覆盖）。

七、 质量控制与注意事项

1. 无菌操作： 全程严格无菌操作，在生物安全柜/超净台进行。
2. 培养基质量： 使用前检查无菌性、pH及促生长能力（质控菌株验证）。
3. 温度控制： 水浴锅精确控温（46±1℃），防止烫死微生物。
4. 稀释精度： 确保稀释液体积准确，更换吸管/吸头，充分混匀。
5. 平板凝固： 倾倒后确保琼脂完全凝固再翻转培养。
6. 防止蔓延：
   • 琼脂完全凝固后再移动。
   • 避免冷凝水滴落。
   • 倾注培养基温度勿过高（<50℃）。
   • 确保培养基干燥度。
   • 涂布法时稀释液应被琼脂充分吸收。
7. 及时计数： 培养后尽快计数（通常4小时内），避免菌落生长过大或干燥。
8. 平行试验： 每个稀释度至少做两个平行平板，误差应满足标准要求（如≤15%对数差）。
9. 记录完整： 详细记录样品信息、操作步骤、观察现象、计算结果。
10. 生物安全： 按规定处理废弃物和受污染物品。

八、 常见问题与解决方法

• 菌落过多/过少： 重新评估样品特性，调整稀释梯度。
• 蔓延菌落严重： 检查培养基干燥度、倾注温度、冷凝水；考虑使用表面干燥培养基平板或含TTC的培养基抑制蔓延。
• 菌落形态混杂： 根据检测目标判断是否需要分型计数。
• 空白长菌： 检查稀释液、培养基、耗材、操作环境灭菌效果。
• 结果重复性差： 检查操作规范性（尤其是混匀）、仪器校准、人员操作差异。

关键提示： 本规程为通用指南。具体操作应严格遵守所执行的国家标准（如中国GB 4789.2）或国际标准（如ISO 4833-1）的最新版本要求。务必在专业指导下进行实验操作。