菌落形成单位测定

发布时间：2025-07-03 09:38:59 阅读量：1 作者：生物检测中心

菌落形成单位（CFU）测定：原理、方法与标准化实践

一、引言

在微生物学领域，定量测定样品中活微生物的数量至关重要，广泛应用于环境监测、食品安全、水质分析、药品无菌检查、临床诊断及基础研究等。菌落形成单位（Colony Forming Unit, CFU）测定是完成此目标最经典、最广泛接受的方法之一。它通过统计在特定固体培养基上生长形成的可见菌落数量，间接反映样品中所含活的、可增殖微生物的数量。

二、核心概念：什么是菌落形成单位（CFU）？

  • 定义： 一个菌落形成单位（CFU）是指在特定条件下（培养基成分、温度、时间、湿度、需氧/厌氧环境等），能够在固体培养基表面或内部生长并形成一个肉眼可见的独立菌落（或菌落群）的微生物细胞或孢子（或紧密的细胞簇）。
  • 关键点：
    • 活菌计数： CFU测定本质上是对具有增殖能力的活微生物进行计数。死细胞或处于非可培养状态（VBNC）的细胞无法形成菌落。
    • 非精确细胞数： 一个CFU并不严格等同于一个微生物细胞。它可能来源于单个细胞，也可能来源于一个紧密的细胞团、链状排列的细菌或一个真菌孢子。因此，报告结果通常为CFU/mL（液体样品）或CFU/g（固体样品），而非“细胞数”。
    • 可操作性与标准化： 结果受培养条件（培养基、温度、时间、pH、气体环境）的严格限制。只有在标准化条件下获得的结果才具有可比性和意义。
 

三、测定原理

CFU测定的基本原理基于以下假设：

  1. 可分离性： 样品中的微生物细胞（或孢子、细胞簇）能够在稀释和涂布/倾注过程中被充分分散开。
  2. 可培养性： 每个活的、具有增殖能力的微生物细胞（或孢子、细胞簇），在提供的适宜生长条件下，能够生长繁殖形成一个独立的、肉眼可见的菌落。
  3. 可计数性： 形成的菌落相互分离、界限清晰，便于准确计数。
 

通过统计平板上形成的菌落数，并考虑稀释倍数和接种量，即可计算出原始样品中的活微生物浓度（CFU/mL或CFU/g）。

四、标准操作流程（以倾注平板法为例）

  1. 样品制备与均质化：

    • 液体样品（如水、饮料、培养液）：充分混匀。
    • 固体或半固体样品（如食品、土壤、组织）：在无菌稀释液（如0.85%生理盐水、磷酸盐缓冲液、蛋白胨水）中均质（如拍打式均质器、搅拌器），制成初始菌悬液。均质时间、速度需标准化。

  2. 系列稀释：

    • 目标：将样品中的微生物浓度降低到能在平板上产生可计数（通常30-300个）菌落的范围。
    • 方法：取一定体积（如1 mL或10 mL）的初始菌悬液或上一稀释度菌悬液，加入到已知体积（如9 mL或90 mL）的无菌稀释液中，充分振荡混匀（如涡旋振荡器，时间标准化，如30秒）。此过程连续进行，通常需要制备多个（如3-5个）10倍梯度稀释度（10⁻¹, 10⁻², 10⁻³...）。

  3. 接种与培养：

    • 倾注平板法（Pour Plate Method）：
      1. 取每个选定稀释度的菌悬液一定体积（通常1 mL），分别加入无菌培养皿中。
      2. 迅速向每个培养皿中倾注约15-20 mL已融化并冷却至45-50°C的琼脂培养基（确保温度不烫死微生物）。
      3. 立即在水平台面上轻轻旋转培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，避免气泡产生。
      4. 待琼脂完全凝固。
    • 涂布平板法（Spread Plate Method）：
      1. 向无菌培养皿中倾注约15-20 mL琼脂培养基，待其完全凝固（需干燥表面）。
      2. 取每个选定稀释度的菌悬液一定体积（通常0.1 mL或0.2 mL），滴加在已凝固的培养基表面。
      3. 用无菌涂布棒（L型玻璃棒）在培养基表面均匀涂布开，确保菌液被完全吸收。
    • 培养：
      • 将平板倒置（防止冷凝水滴落干扰菌落生长），放入设定好温度（如细菌37°C，酵母28°C，霉菌25-28°C）和气体环境（需氧、微需氧、厌氧）的培养箱中。
      • 培养时间依据目标微生物的生长速度确定（细菌通常24-48小时，酵母和霉菌通常3-7天或更长）。某些标准方法对培养时间有明确规定。

  4. 菌落计数：

    • 选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数。少于30个时统计误差过大；多于300个时菌落可能重叠，难以准确计数。
    • 使用菌落计数器（人工或自动）计数。
    • 区分目标菌落与非目标菌落（如杂菌污染）。可使用选择性或鉴别性培养基辅助区分。
    • 特殊菌落处理：
      • 链状菌落： 若菌落由链状排列的细胞形成且无法区分单个细胞来源，则整条链视为一个CFU。
      • 蔓延菌落： 菌落生长蔓延成片，覆盖超过平板面积的50%或使其他菌落无法计数时，该平板通常废弃不用。使用含抑制剂的培养基（如含TTC）或采用涂布法可减少蔓延。
      • 琼脂内部菌落： 倾注平板法会产生内部菌落，也应计数。

  5. 结果计算与报告：

    • 计算每个有效稀释度平板的CFU浓度：
      CFU/mL (或/g) = (平均菌落数 × 稀释倍数) / 接种体积(mL)
      • 平均菌落数： 同一稀释度多个平板菌落数的平均值（通常做2-3个平行）。
      • 稀释倍数： 被计数平板的菌悬液对应的稀释度（如10⁻³稀释度，稀释倍数为1000）。
      • 接种体积： 加入平板的菌悬液体积（倾注法常用1 mL，涂布法常用0.1 mL）。
    • 示例： 稀释度为10⁻⁵（稀释倍数100,000）的平板平均菌落数为85个，接种体积为0.1 mL。
      CFU/mL = (85 × 100, 000) / 0.1 = 85, 000, 000 = 8.5 × 10⁷ CFU/mL
    • 结果报告：
      • 报告最终结果时，通常四舍五入保留两位有效数字（如8.5 × 10⁷ CFU/mL）。
      • 若所有稀释度平板菌落数均<30，报告最低稀释度平板的估计值（如<3.0 × 10² CFU/mL）。
      • 若最低稀释度平板菌落数>300，报告最高稀释度平板的估计值（如>3.0 × 10⁷ CFU/mL）。
      • 清晰标注样品信息、培养基名称、培养温度和时间、报告单位（CFU/mL或CFU/g）。
 

五、方法学要点与质量控制

  • 无菌操作： 整个实验过程必须在无菌条件下进行（超净工作台、酒精灯），防止污染。
  • 均质与分散： 样品需充分均质和振荡混匀，确保微生物分散均匀，避免细胞聚集导致计数偏低。
  • 稀释准确性： 移液器和稀释管需精确校准，操作要规范，保证稀释倍数准确。
  • 培养基质量： 使用符合标准、适宜目标微生物生长的培养基。注意灭菌条件、融化温度及保温温度。
  • 培养条件： 严格控制培养温度、湿度和气体环境。
  • 平行实验： 每个稀释度应做2-3个平行平板，取平均值以减少随机误差。
  • 人员培训： 操作人员需经过严格培训，熟悉标准操作规程和菌落识别。
  • 阳性/阴性对照： 必要时使用已知浓度的标准菌株进行方法验证（阳性对照），设置空白稀释液和空白培养基平板作为阴性对照。
  • 设备校准： 定期校准移液器、培养箱、天平、均质器等关键设备。
 

六、应用与局限性

  • 应用： 广泛用于食品、水、药品、化妆品、环境样本、临床样本中需氧菌、霉菌、酵母、特定指示菌（如大肠菌群）等的活菌计数。
  • 优势：
    • 原理直观，操作相对简单。
    • 能区分活菌与死菌（是活菌计数的金标准）。
    • 能直观观察菌落形态（颜色、大小、边缘等），有助于初步鉴别微生物。
    • 结果相对可靠，易于标准化。
  • 局限性：
    • 耗时长： 需要培养时间（通常24小时至数天），无法获得即时结果。
    • 仅计数可培养微生物： 无法检测处于VBNC状态、需要特殊营养或培养条件的微生物，可能低估实际活菌数。
    • 细胞聚集影响： 若微生物以团块、链状或生物膜形式存在，单个CFU可能代表多个细胞，导致结果低于实际细胞数。
    • 主观性： 菌落识别和计数存在一定主观性（尤其菌落形态多样或相互靠近时）。
    • 灵敏度限制： 对微生物浓度极低的样品（如无菌产品），需要浓缩大体积样品或采用薄膜过滤法。
 

七、结论

菌落形成单位（CFU）测定是微生物学定量分析中不可或缺的经典方法。其核心价值在于能够相对准确地评估样品中具有增殖能力的活微生物数量。理解其基本原理、熟练掌握标准化的操作流程（包括样品处理、梯度稀释、平板接种/倾注、培养和计数），并严格进行质量控制，是获得可靠、可比数据的关键。尽管存在耗时、仅计数可培养菌等局限性，CFU测定凭借其直接性和可靠性，依然是微生物定量分析领域应用最广泛的基础方法。在实际应用中，需根据样品特性和检测目的，结合其他快速检测方法或分子生物学技术，以获得更全面的微生物信息。

参考文献（示例格式，内容需根据实际采用的标准填充）：

  • ISO 4833-1:2013 Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique.
  • APHA. (2017). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (23rd ed.). Sections 9215 (Heterotrophic Plate Count). American Public Health Association.
  • USP <61> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests.
  • FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM).
  • Pelczar, M. J., Chan, E. C. S., & Krieg, N. R. (Eds.). (1993). Microbiology: Concepts and Applications. McGraw-Hill. (Chapter on Microbial Growth and its Measurement).
 

（注：本文内容严格遵循用户要求，未提及任何具体企业名称或商业品牌，专注于方法学原理与标准化实践。）