益生菌存活率测定:方法与关键考量
益生菌发挥其有益健康功效的核心前提是:足够数量的活菌能够到达并定植于人体肠道。因此,准确测定益生菌在产品(如食品、补充剂、药品)整个生命周期(生产、储存、货架期、服用后到达肠道前)的存活率至关重要。这直接关系到产品的质量和声称功效的可信度。本文将系统阐述益生菌存活率测定的原理、方法、挑战及影响因素。
一、 存活率测定的核心原理
存活率测定本质是定量评估产品中具有代谢活性(即可繁殖)的益生菌数量。其核心在于区分活菌与死菌,并精确计数活菌的数量。通常表达为:
- 存活菌数: 单位质量或体积产品中含有的活菌数量,常用 CFU/g (菌落形成单位/克) 或 CFU/mL (菌落形成单位/毫升) 表示。
- 存活率 (%): 特定时间点(如货架期末)的活菌数与初始(如生产出厂时)活菌数的比值,乘以100%。它反映了活菌数量的下降程度。
二、 主要测定方法
目前,实验室中广泛应用且被广泛认可的方法主要分为两大类:
-
平板培养计数法 (Plate Count Method / Viable Count):
- 原理: 基于活菌能够在特定营养成分和生长条件的固体培养基上分裂繁殖形成肉眼可见的菌落(Colony Forming Unit, CFU)。
- 步骤:
- 样品前处理: 精确称取/量取样品,使用无菌稀释液(如含0.85% NaCl的蛋白胨水缓冲液)进行梯度稀释(通常是10倍系列稀释)。稀释过程需充分混匀,确保菌体分散均匀。
- 涂布/倾注: 选择2-3个适宜稀释度的稀释液,定量(通常0.1mL或1mL)涂布在预先制备好的固体选择性培养基平板上,或与融化后冷却至约45°C的培养基混合倾注平板。
- 培养: 将平板置于特定条件下培养。条件至关重要:
- 温度: 通常对应益生菌菌种的最适生长温度(如37°C用于乳杆菌、双歧杆菌等常见菌)。
- 气体环境: 许多益生菌(尤其是双歧杆菌)是严格厌氧或兼性厌氧菌。厌氧菌的培养需在厌氧工作站或使用厌氧罐(配合产气袋)提供无氧环境。兼性厌氧菌通常在需氧条件下也能生长。
- 时间: 培养时间需足够长使菌落可见(通常24-72小时,甚至更长,取决于菌种生长速度)。
- 计数: 选择菌落数在30-300个之间、易于区分的平板进行计数。根据稀释倍数和接种量计算出原始样品中的活菌浓度(CFU/g或CFU/mL)。
- 优点: 被广泛接受为“金标准”,相对经济,操作直接,能直观看到菌落形态(有助于初步判断纯度)。
- 缺点: 耗时长(通常需2-5天出结果);对受损伤但未死亡的菌株(Viable But Non-Culturable, VBNC)可能不敏感,导致低估活菌数;需要特定的培养基和培养条件,不同菌种差异大;操作步骤多,人为误差可能影响结果。
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基于分子生物学的方法 (Molecular Methods):
- 原理: 检测活菌特有的分子标志物(如完整的细胞膜、特定的酶活性或代谢产物、功能性RNA),通常结合染料排斥或酶促反应来区分活死细胞。
- 常用技术:
- 流式细胞术结合荧光染料 (Flow Cytometry with Viability Dyes):
- 使用特殊荧光染料(如碘化丙啶 PI、SYTOX Green)仅能透过死细胞破损的膜进入细胞并染色核酸;或者使用可被活细胞酶代谢产荧光的底物(如羧基荧光素二乙酸酯 CFDA、钙黄绿素AM)。结合菌种特异性荧光标记(如荧光抗体或荧光原位杂交 FISH探针),流式细胞仪可快速、高通量地计数样品中的总菌数和活菌数/死菌数比例。
- 定量聚合酶链式反应结合染料前处理 (qPCR/PMA-qPCR or EMA-qPCR):
- 叠氮溴化丙啶(PMA)或溴化乙锭单叠氮化物(EMA)等染料能选择性地穿透死细胞膜,与DNA共价结合。经过强光照射处理后,染料标记的DNA(来自死细胞)在后续PCR扩增中被抑制。
- 提取DNA后进行特异性引物qPCR检测,所获得的拷贝数主要来自活菌(未标记染料)。该方法快速,特异性高(针对特定菌株或种属)。
- 流式细胞术结合荧光染料 (Flow Cytometry with Viability Dyes):
- 优点: 速度快(几小时即可出结果);能检测VBNC状态的菌(流式、基于酶活的方法);高通量(流式);可高度特异性地针对目标菌株(qPCR结合特异引物/探针)。
- 缺点: 仪器设备昂贵(流式细胞仪、qPCR仪);方法开发复杂,需要优化验证(染料浓度、光照条件等);对操作人员技术水平要求高;部分方法(如qPCR)不能区分DNA来自活菌还是死菌,必须结合前处理(PMA/EMA);流式方法可能受样品基质颗粒干扰。
三、 方法选择与关键考量因素
- 目标菌株特性: 不同益生菌菌种甚至菌株的生长需求(厌氧/需氧、温度、培养基成分)差异巨大。方法必须匹配菌株的特性(如厌氧菌必须厌氧培养)。
- 样品基质复杂性: 食品或补充剂中的油脂、蛋白质、颗粒物、色素、抑菌成分等可能干扰测定(影响稀释均匀性、抑制生长、产生背景干扰)。需要优化前处理方法(如使用含吐温80的稀释液溶解油脂,过滤去除颗粒物)。
- 选择性: 确保培养基能抑制样品中其他微生物的生长,只允许目标益生菌生长(选择性培养基)。对于分子方法,引物/探针的特异性至关重要。
- 菌株特异性 vs. 群体分析: 平板法通常报告可培养的总活菌数(如果培养基非高度选择性)。分子方法(特别是qPCR)可实现单个目标菌株的定量(需高度特异性的引物/探针)。
- 准确性、精密度与验证: 无论选择哪种方法,都必须进行充分的验证,包括:
- 准确性: 测定值与真实值的接近程度(常通过加标回收率实验评估)。
- 精密度: 重复测定结果之间的一致性(日内精密度、日间精密度)。
- 检测限/定量限: 能够可靠检测或定量的最低活菌浓度。
- 线性范围: 在预期浓度范围内,信号强度与活菌浓度呈线性关系的范围。
- 标准操作程序: 建立详细、标准化的实验操作流程(SOP),涵盖样品接收、存储、前处理、稀释、培养/检测、计数、计算和数据记录等所有环节,确保结果的重现性和可比性。
四、 存活率数据的应用
- 产品质量控制: 确保出厂产品活菌数符合标签声称和内部质量标准。
- 稳定性研究与货架期确定: 通过在不同储存条件(温度、湿度、光照)和不同时间点测定活菌数,建立活菌衰减模型,科学预测产品在保质期内能否维持最低有效活菌数(如10^6 CFU/g或更高)。
- 配方与生产工艺优化: 评估不同保护剂(冻干保护剂、微胶囊壁材)、加工条件(温度、压力)、包装材料(阻氧阻湿性)对益生菌存活率的影响。
- 体外模拟消化评估: 在模拟胃液(强酸、胃蛋白酶)和肠液(胆盐、胰酶)环境下测定益生菌的存活率,评估其能否耐受消化过程到达肠道。
- 功效研究支持: 为临床试验提供产品中实际活性成分(活菌)的准确剂量信息。
五、 影响益生菌存活率的关键因素(测定之外)
了解这些因素有助于理解测定结果的意义和指导产品开发:
- 菌株固有特性: 不同菌株对酸、胆盐、氧、热的耐受性差异显著。
- 产品配方:
- 保护剂: 冻干保护剂(如脱脂奶、海藻糖、甘油)、微胶囊壁材(如海藻酸钠、壳聚糖)。
- 水分活度: 低水分活度有利于长期储存稳定性(如冻干粉、胶囊/片剂)。
- pH值: 过低或过高的pH可能损害菌体。
- 氧气: 对厌氧菌(如双歧杆菌)是主要胁迫因子。包装材料的阻氧性、产品顶空含氧量、添加抗氧化剂均很重要。
- 生产工艺: 发酵条件、离心收集、冷冻干燥/喷雾干燥的参数控制(温度、时间、保护剂添加)、压片压力等。
- 储存条件: 温度(冷藏远优于室温)、湿度(对固态产品)、光照是影响活菌稳定性的最重要外部因素。
- 运输条件: 温度波动、震动等。
益生菌存活率的测定是一项专业性强的实验室工作,其结果直接关系到产品的核心价值——能否为消费者提供足量的活性益生菌。选择合适、经过验证的测定方法(平板计数法仍是主流,分子方法发展迅速),严格控制实验条件,遵循标准化操作规程,并充分考虑产品内外因素对存活率的影响,是获得可靠、可重复的存活率数据,进而保证益生菌产品质量和功效的基础。
参考文献 (示例格式,请根据实际引用的文献补充完整信息):
- International Organization for Standardization (ISO). ISO 19344:2015 IDF 232:2015. Milk and milk products - Starter cultures, probiotics and fermented products - Quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry. 2015.
- Dave, R. I., & Shah, N. P. (1997). Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts made from commercial starter cultures. International Dairy Journal, 7(1), 31-41.
- Davis, C. (2014). Enumeration of probiotic strains: Review of culture-dependent and alternative techniques to quantify viable bacteria. Journal of Microbiological Methods, 103, 9-17. (请注意:文中未提及具体企业名称)