益生菌CFU测定

益生菌CFU测定：原理、方法与实践要点

CFU测定（菌落形成单位计数）是评估益生菌产品活性的黄金标准方法。其结果直接反映产品中具有繁殖能力的活菌数量，对保证益生菌效能、产品质量控制和法规遵循至关重要。

一、核心原理

通过定量稀释样品，使益生菌细胞分散在培养基上，在适宜的生长条件下培养后，每个活细胞（或可形成菌落的细胞团）会生长、繁殖形成一个肉眼可见的菌落。统计特定稀释度下生长的典型菌落数，即可回溯计算出原始样品中的活菌浓度（通常表示为CFU/g 或 CFU/mL）。

二、关键步骤与操作要点

1. 样品准备与均质化

   • 样品复苏： 冷冻或冻干样品需在适当条件下（如推荐温度、时间）复活。严格遵循样品说明（避免使用说明书之外的复水溶剂）。
   • 均质化： 使用无菌稀释液（如0.85%生理盐水、磷酸盐缓冲液或特定缓冲液）将样品充分溶解或悬浮。关键： 确保彻底、均匀分散！使用无菌均质袋/均质器剧烈摇晃或拍打，或涡旋振荡器充分混匀。固体样品（如胶囊粉、片剂粉末）需研磨成细粉后溶解。均质化不全会导致结果严重偏低。

2. 梯度稀释

   • 使用无菌移液技术，将均质后的样品进行十倍系列稀释（例如：1:10, 1:100, 1:1000...）。
   • 关键： 无菌操作！ 每个稀释步骤需更换无菌吸头/吸管，并在稀释管中充分混匀后再吸取下一稀释度。选择合适的稀释梯度至关重要，目标是最终平板上有30-300个可清晰计数的菌落。

3. 接种与培养

   • 倾注平板法（首选）：
     • 选取2-3个目标稀释度（预计菌落在30-300 CFU）。
     • 取1mL稀释液加入无菌培养皿中。
     • 倒入熔化并冷却至45-50°C的选择性琼脂培养基（如MRS用于乳酸杆菌/双歧杆菌，M17用于链球菌/乳球菌，特定培养基需匹配目标菌种）。
     • 立即轻轻旋动平板，使样品与培养基充分混匀。待琼脂凝固。
   • 涂布平板法：
     • 吸取0.1mL或0.05mL稀释液滴在已凝固的琼脂平板上。
     • 用无菌涂布棒均匀涂布于整个表面。
   • 关键： 培养基选择必须支持目标益生菌生长并抑制背景菌。无菌操作防止污染。确保培养基温度合适，避免烫死益生菌。
   • 培养： 平板倒置放入设定好的恒温培养箱中。培养条件（温度、时间、气体环境 - 如厌氧罐用于厌氧菌）必须严格符合目标益生菌的生长特性（通常37°C乳酸菌需培养48-72小时，双歧杆菌在厌氧条件下需72小时）。培养时间不足或条件错误会导致计数偏低。

4. 菌落计数

   • 选择菌落数在30 - 300 CFU之间（涂布法为15-150 CFU）的平板进行计数。避免蔓延生长、模糊不清或明显污染的平板。
   • 关键： 使用菌落计数器或手动标记计数，准确识别目标菌落的特征（形态、颜色）。同一稀释度做多个平行平板（通常≥2个），计算平均值。

5. 结果计算

   • 公式：CFU/g (或 mL) = (平均菌落数 × 稀释倍数) / 接种体积(L)
   • 举例（倾注法，接种1mL）：
     • 某稀释度（10^-6）平板平均菌落数为85个。
     • 计算结果 = (85 × 1,000,000) / 0.001 = 85 × 10^6 CFU/g (mL) = 8.5 × 10^7 CFU/g (mL)
   • 报告： 以科学计数法报告结果（如2.4 × 10^9 CFU/g），保留两位有效数字，并标明置信区间（如有）。

三、质量控制与误差来源

• 培养基验证： 使用标准菌株验证培养基的选择性和促生长能力。
• 无菌操作： 所有步骤需在洁净环境（如超净工作台）中进行，防止微生物污染。
• 设备校准： 移液器、培养箱定期检定。
• 人员培训： 操作人员需熟练掌握无菌技术和菌落识别。
• 平行试验： 增加平行样和平板数可提高结果可靠性。
• 常见误差来源：
  • 样品不均质： 最大误差来源，导致结果偏低且重现性差。
  • 稀释错误： 吸液不准、未换吸头、混匀不足。
  • 菌落识别错误： 目标菌落特征不熟悉，误判非目标菌落或遗漏微小菌落。
  • 培养条件不当： 温度、时间、气体不符合要求。
  • 蔓延菌落干扰计数。
  • 培养基不适： 无法支持目标菌生长或无法抑制杂菌。

四、替代方法与注意事项

• 流式细胞术+荧光染色（如PI/SYTO9）： 可快速区分活/死菌，但设备昂贵，需专业操作，结果可能与CFU有差异（检测的是“可培养能力”之外的代谢状态）。
• 选择依据： CFU法仍是法规和标准（如ISO 7889， ISO 19344）最广泛认可的方法，尤其用于产品标示和质控。其他方法可作为补充或研发工具。
• 复杂基质： 含多种益生菌或不溶性成分的产品，需优化均质和分离方法。
• 活力与功能： CFU计数仅反映可培养活菌数，不代表菌株功能活性。 功能评价需其他体外/体内试验。

总结：

益生菌CFU测定是评估产品活菌数量的基石方法。其准确性依赖于严格的标准化操作流程、无菌技术、适宜的培养基与培养条件选择以及经验丰富的操作人员。理解每一步骤的关键控制点并有效管理误差来源，是获得可靠、可重复检测结果的保障。持续的质量控制和人员培训是维持实验室检测能力的关键。该方法为益生菌产品的研发、生产、质量监控和货架期稳定性研究提供了不可或缺的核心数据支持。