益生菌活菌计数

发布时间：2025-07-03 09:25:20 阅读量：2 作者：生物检测中心

益生菌活菌计数：原理、方法与挑战

一、 核心概念与重要性

益生菌活菌计数是指定量测定特定产品（如食品、膳食补充剂、药品）或样品中具有代谢活性、能够生长繁殖的益生菌细胞数量的过程。其核心价值在于：

  1. 功效保障： 大量科学研究表明，益生菌的健康功效（如调节肠道菌群、增强免疫、缓解特定消化不适等）通常具有“剂量依赖性”，即需要摄入足够数量的活菌才能达到预期效果。活菌计数是确保产品实际功效的关键指标。
  2. 质量控制： 它是益生菌产品生产、储存、运输和销售全过程中不可或缺的质量控制环节，确保产品在货架期内活菌数符合标签声称或法规要求。
  3. 稳定性评估： 通过监测不同时间点和储存条件下的活菌数变化，可以评估产品的稳定性，优化配方和包装。
  4. 科研基础： 在益生菌作用机制、菌株筛选、剂量效应关系等研究中，活菌计数提供基础数据支持。
  5. 法规符合性： 许多国家和地区的法规对益生菌产品的活菌数有明确要求（如最低限量和保质期末限值），活菌计数是合规性的证明。
 

二、 主要计数方法

目前最常用、被广泛接受为“金标准”的方法是 平板计数法（Plate Count Method），也称为活菌计数法（Viable Count）或菌落形成单位计数法（Colony Forming Unit Count, CFU Count）。

  • 基本原理： 假设一个活的、具有繁殖能力的益生菌细胞，在适宜的固体培养基上和特定的环境条件下，能够生长分裂形成一个肉眼可见的菌落。通过计数培养后形成的菌落数量，结合样品稀释倍数，即可推算出原始样品中的活菌数量。

  • 核心步骤：

    1. 样品制备与均质化： 将样品（如胶囊内容物、粉末、液态产品）在无菌稀释液（如0.85%生理盐水、磷酸盐缓冲液）中充分溶解、混匀、均质，确保菌体分散。
    2. 系列稀释： 将均质后的样品进行一系列10倍梯度稀释（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, ..., 10⁻⁸）。这是关键步骤，目的是将菌液稀释到合适浓度，以便在平板上长出可清晰分辨的菌落（通常目标为每平板30-300个菌落）。
    3. 涂布或倾注：
      • 涂布法： 取一定量（如0.1 mL）的适宜稀释度菌液，滴加到已凝固的固体培养基平板上，用无菌涂布棒均匀涂布开。
      • 倾注法： 取一定量（如1 mL）的适宜稀释度菌液，加入无菌培养皿中，然后倾入约15 mL已融化并冷却至约45°C的固体培养基，迅速摇匀混匀，待其凝固。
    4. 培养： 将平板倒置放入设定好温度（通常30-37°C，依菌种而定）和气体环境（需氧、厌氧或微需氧，依菌种而定）的培养箱中，培养一定时间（通常24-72小时）。
    5. 菌落计数： 培养结束后，选择长有30-300个菌落的平板进行计数。肉眼观察计数或借助菌落计数器。小于30个菌落的平板数据可靠性低（统计误差大），大于300个菌落的平板可能因菌落重叠导致计数偏低。
    6. 结果计算： 活菌数 (CFU/g 或 CFU/mL) = 平均菌落数 × 稀释倍数 × (1 / 接种体积(mL))。例如，某稀释度为10⁻⁶的平板平均菌落数为85个，接种体积为0.1 mL，则活菌数 = 85 × 10⁶ × (1 / 0.1) = 8.5 × 10⁹ CFU/g (或 mL)。

  • 关键要素：

    • 培养基选择： 必须使用能够支持目标益生菌生长并抑制非目标微生物生长的选择性或非选择性培养基（如MRS用于乳酸菌、Bifidobacterium选择性培养基用于双歧杆菌）。
    • 培养条件： 温度、时间、气体环境（O₂、CO₂、N₂）必须严格匹配目标益生菌的生长需求。
    • 操作规范： 无菌操作至关重要，避免污染。均质、稀释、涂布/倾注等操作需规范熟练，减少误差。
    • 确认试验： 有时需要随机挑取典型菌落进行镜检、生化试验或分子生物学鉴定（如PCR），以确认其为目标益生菌而非杂菌。
 

三、 方法优势与局限性

  • 优势：
    • 直接检测具有繁殖能力的活菌，与益生菌的功效潜力直接相关。
    • 方法成熟、标准化程度相对较高（有国际或国家标准参考，如ISO 7889等）。
    • 设备和成本要求相对较低（主要需要无菌室/超净台、培养箱、移液器、培养皿等）。
    • 结果直观，易于理解和接受。
  • 局限性：
    • 耗时长： 通常需要2-5天才能获得结果。
    • 仅计数可培养菌： 无法检测处于“活的非可培养状态”（Viable But Non-Culturable, VBNC）的菌细胞。这些细胞可能仍有代谢活性甚至潜在功效，但在当前培养条件下无法形成菌落。
    • 低估风险： 若益生菌在样品中成链、成簇聚集，或与样品基质结合紧密，一个菌落可能由多个细胞形成，导致实际活菌数被低估。
    • 培养基和培养条件限制： 培养基可能无法完美支持所有目标菌株生长，或无法完全抑制所有杂菌生长。培养条件（如厌氧环境）的控制也可能影响结果准确性。
    • 操作误差： 稀释误差、涂布不均、菌落识别错误（如微小菌落、扩散生长菌落）等都可能引入人为误差。
    • 结果变异性： 微生物计数本身存在固有的生物变异性和操作变异性，不同实验室或操作者间结果可能存在差异。
 

四、 其他方法与技术进展

为克服平板法的局限性，研究者们也在探索和发展其他方法：

  • 流式细胞术结合荧光染色 (Flow Cytometry with Viability Stains)：
    • 原理：使用特殊荧光染料（如PI/SYTO 9双染）区分样品中的活细胞（完整细胞膜）、死细胞（破损细胞膜）和总细胞。通过流式细胞仪快速（几分钟到几十分钟）检测和计数。
    • 优点：速度快，可区分死活状态，能检测VBNC细胞（部分染料），自动化程度高。
    • 挑战：设备昂贵；样品前处理（如去除颗粒干扰）和染色方案优化复杂；结果可能受染料特性、样品基质影响；区分活死状态有时不如平板法“可繁殖”的定义直接。
  • 定量聚合酶链式反应 (Quantitative PCR, qPCR)：
    • 原理：特异性扩增目标益生菌的DNA片段（通常是特定基因），通过荧光信号实时监测扩增过程，定量目标DNA的量，从而间接反映菌体数量。
    • 优点：特异性高，速度快（几小时），灵敏度高，可检测难以培养的菌种。
    • 挑战：无法区分活菌与死菌（死菌的DNA也能被扩增），这是用于活菌计数的最大障碍。需结合前处理（如叠氮溴化丙啶PMAxx处理可选择性地抑制死菌DNA扩增）来提高特异性。DNA提取效率、PCR抑制物（来自样品基质）、引物/探针设计等影响结果准确性。通常需要已知浓度的标准品进行校准，结果单位为基因拷贝数，转换为CFU存在不确定性。
  • 下一代测序 (Next Generation Sequencing, NGS)：
    • 原理：对样品中微生物群落的全部或部分基因（如16S rRNA基因）进行高通量测序，分析微生物组成和相对丰度。
    • 优点：可获得全面的群落组成信息，发现未知或难培养菌。
    • 挑战：主要用于定性或半定量（相对丰度）分析，无法提供精确的绝对活菌数量。同样面临无法区分活菌死菌、成本高、数据分析复杂等问题。
  • 等温微量热法 (Isothermal Microcalorimetry)：
    • 原理：检测微生物生长代谢过程中产生的微小热量变化，绘制热功率-时间曲线，通过曲线特征来定量活菌。
    • 优点：无需培养形成菌落，可实时在线监测生长。
    • 挑战：设备特殊，应用尚不广泛，结果解释和定量模型需进一步研究。
 

五、 挑战与展望

益生菌活菌计数仍面临诸多挑战：

  1. “活菌”定义的复杂性： 传统CFU定义（可繁殖）与VBNC状态、代谢活性等概念的冲突。如何更全面地定义和检测具有潜在健康益处的“功能性活菌”是核心难题。
  2. 方法的标准化与一致性： 不同方法（甚至同一方法在不同实验室）的结果可比性仍需提高。需要更完善的国际和国家标准。
  3. 基质干扰： 复杂的食品或补充剂基质（如油脂、蛋白质、颗粒物、抑制剂）对样品前处理、菌体释放、染色效果、PCR效率等造成干扰。
  4. 菌株特异性： 不同益生菌菌株的生长特性、聚集倾向、对培养条件/染料的敏感性可能不同，需要方法优化。
  5. 快速、准确、低成本方法的开发： 平衡速度、准确性、成本和可及性。
 

未来发展趋势包括：

  • 优化现有方法（如开发更特异的培养基、染色方案、样品前处理方法）。
  • 推动流式细胞术、qPCR/PMAxx等快速方法的标准建立和验证。
  • 探索多技术联用（如结合流式、qPCR和培养）。
  • 发展基于代谢活性（如ATP生物发光法）或特定功能基因表达的新型检测技术。
  • 利用人工智能辅助菌落识别和数据分析。
 

六、 结论

益生菌活菌计数是确保产品质量、功效和合规性的基石。平板计数法（CFU法）作为当前主流和标准方法，有其不可替代的优势，但也存在耗时、低估等局限。流式细胞术、qPCR等新兴技术提供了更快的选择，但各自面临区分死活菌、标准化等挑战。选择何种方法需根据具体需求（如检测目的、时效要求、预算、样品类型、目标菌株特性）进行权衡。随着研究的深入和技术的进步，更快速、准确、能更好反映益生菌功能活性的计数方法将是未来的发展方向。持续优化方法、推动标准化和深入理解“活菌”的生物学含义，对于益生菌行业的健康发展和消费者信任至关重要。