基质干扰回收率测定

基质干扰回收率测定方法指南

一、 定义与目的

• 基质干扰： 指样品中与被分析物共存的组分（如蛋白质、脂类、盐分、色素、其它化合物等）对分析方法准确测定目标分析物产生的干扰效应。可能表现为信号抑制、信号增强或间接影响分析过程的稳定性。
• 基质回收率： 在已知浓度的空白基质样品（模拟实际样品基质但不含目标分析物）中，定量加入已知量的目标分析物（加标样品），经前处理和分析后，测得的目标分析物浓度与理论加入浓度的比值，通常以百分比表示。
• 测定目的：
  • 评估待测样品基质对分析方法准确度（主要体现为正确度）的影响程度。
  • 验证分析方法在特定基质条件下定量结果的可靠性。
  • 识别和量化基质效应（Matrix Effect）。
  • 优化或调整样品前处理程序和仪器参数，以克服基质干扰。
  • 是方法学验证（尤其在复杂基质如生物体液、食品、环境样品分析中）的关键环节。

二、 实验原理

通过在空白基质中添加已知量的目标分析物（加标），经过与真实样品完全相同的样品前处理（如提取、净化、浓缩、衍生化等）和分析检测（如HPLC, GC, LC-MS/MS, ICP-MS, ELISA等）过程，将测得的加标样品中目标物浓度与理论加入浓度进行比较。回收率接近100%表明基质干扰小，方法准确度高；回收率显著偏离100%（偏高或偏低）则表明存在显著的基质效应，需要进行方法优化或校正。

三、 材料与设备

1. 空白基质： 不含目标分析物的样品基质。制备是关键，需尽可能模拟实际样品的组成。
   • 常见来源： 阴性生物样本（如空白血浆、血清、尿液）、未污染的环境样品（如超纯水模拟洁净水样）、空白食品匀浆（如目标物残留为0的同类型食品）、空白土壤提取液等。
   • 验证： 需经过可靠方法确证其不含目标分析物或含量远低于方法定量限。
2. 目标分析物标准品： 高纯度、已知浓度的标准物质。
3. 加标溶液： 用适当溶剂（常为甲醇、乙腈或水）配制目标分析物标准溶液，浓度需精确已知。
4. 试剂： 分析所需的所有试剂（如提取溶剂、缓冲液、衍生化试剂等），应为分析纯或更高等级。
5. 仪器设备：
   • 分析天平（精确至0.1mg或更高）
   • 微量移液器及合适量程吸头
   • 样品前处理设备（如离心机、涡旋混合器、氮吹仪、固相萃取装置、均质机、超声仪等）
   • 最终分析仪器（如液相色谱仪、气相色谱仪、质谱仪、原子吸收/发射光谱仪、酶标仪等）及其配套数据处理系统。
   • 实验室常用玻璃器皿及塑料器皿（如容量瓶、移液管、离心管、样品瓶等）。

四、 实验步骤

1. 空白基质制备与验证：
   • 获取或制备足够量的空白基质。
   • 使用高灵敏度的分析方法确认空白基质中目标分析物浓度低于方法定量限或检测限，或完全未检出。
2. 加标样品制备：
   • 确定加标水平： 通常至少选择两个浓度水平（低浓度水平接近定量限或预期低浓度，高浓度接近校准曲线上限或预期高浓度）。必要时可增加中间水平。浓度应覆盖方法的实际应用范围。
   • 加标体积： 加标溶液体积应尽量小（通常小于样品体积的1-2%），以减少溶剂效应。若溶剂效应显著，需单独评估。
   • 制备：
     • 取多份（通常n≥5或根据统计要求）等量空白基质（如1.0 mL血浆、1.0 g组织匀浆、100 mL水样）。
     • 向每份基质中加入精确体积的加标溶液。
     • 加入等体积的空白溶剂作为基质加标溶剂对照组（用于评估溶剂影响）。加入等体积的溶剂到纯溶剂（如流动相）中作为溶剂对照组。
     • 充分混合均匀（如涡旋），并根据需要放置一段时间（模拟样品预处理等待时间）。
3. 样品前处理：
   • 将制备好的加标样品、基质加标溶剂对照组、溶剂对照组以及未加标的空白基质样品（用于测定本底和评估基质背景干扰），按照待验证分析方法的样品前处理程序进行处理（如提取、净化、衍生等）。所有步骤应完全一致。
4. 分析检测：
   • 将所有处理后的样品（包括加标样、基质加标溶剂对照、溶剂对照、空白基质样）以及纯溶剂配制的标准溶液（用于建立校准曲线和对比响应），按照设定的仪器分析条件进行检测。
   • 记录所有检测结果（峰面积、峰高、吸光度、计数等响应值）。
5. 数据处理与计算：
   • 根据校准曲线（通常由纯溶剂配制的标准系列建立），计算下列样品的浓度：
     • C_found_spiked: 加标样品中测得的目标分析物浓度。
     • C_found_blank (可选但推荐): 未加标的空白基质样品中测得的目标分析物浓度（即本底值，理想应为0）。
   • 理论加入浓度 (C_added):
     • C_added = (V_spike * C_spike) / V_sample
     • 其中：V_spike 为加入的加标溶液体积，C_spike 为加标溶液浓度，V_sample 为空白基质的体积（或质量，换算为体积需考虑密度）。
   • 回收率计算 (% Recovery):
     • 首选方法（考虑本底）：
       % Recovery = [(C_found_spiked - C_found_blank) / C_added] * 100%
     • 若本底确认极低可忽略或未被检出，常用简化方法：
       % Recovery = (C_found_spiked / C_added) * 100%
   • 计算平均值和精密度：
     • 计算每个加标水平下所有平行样品的回收率平均值。
     • 计算相对标准偏差（RSD%，即变异系数CV%）以评估平行样品回收率的精密度。

五、 结果评估与可接受标准

1. 平均值：
   • 一般可接受范围：80% - 120%。
   • 对于痕量分析（接近定量限水平），可适度放宽，如70% - 130%，但需在方法中明确规定并说明合理性。
   • 具体可接受范围应根据分析方法的目的、基质的复杂性、技术法规要求（如药典、食品安全标准、环境监测标准等）和行业共识制定。
2. 精密度（RSD%）：
   • 通常在低浓度水平要求RSD% ≤ 20%，在高浓度水平要求RSD% ≤ 15%。更严格的要求可能达到RSD% ≤ 10%。
   • 同样需依据具体要求和浓度水平确定。
3. 基质效应评估：
   • 比较基质加标溶剂对照组的平均响应值（峰面积等）与同等浓度的溶剂对照组的平均响应值。
   • 基质效应 (%ME) = (基质加标溶剂对照组响应均值 / 溶剂对照组响应均值) * 100%
   • %ME ≈ 100%：无明显基质效应。
   • %ME < 100%：存在离子抑制效应（尤其在LC-MS中常见）。
   • %ME > 100%：存在离子增强效应。
   • 显著的基质效应（如 |%ME - 100%| > 25%）通常需要通过改进样品前处理（如更有效的净化）、优化色谱分离条件、使用同位素内标物或标准加入法进行校正。

六、 注意事项

1. 空白基质代表性： 确保空白基质尽可能真实地代表待测样品的化学和物理特性。不同来源或批次的基质可能存在差异，必要时应进行评估。
2. 加标浓度合理性： 加标浓度应覆盖方法的实际应用范围，特别是关注低浓度（LOQ附近）的回收率。
3. 加标方式与均一性： 确保加标溶液与基质充分混匀，避免局部浓度过高或过低。加标后应模拟实际样品的状态（如冷冻、冷藏、室温放置）。
4. 平行测定： 每个加标水平应进行足够数量的平行测定（通常n≥5），以保证结果的统计可靠性。
5. 溶剂效应： 控制加标溶剂体积，尽可能小。如果溶剂效应显著，应在结果解释和回收率计算中予以考虑或单独评估。
6. 本底测定： 强烈建议同时测定未加标的空白基质样品，以准确扣除本底干扰。尤其当基质中含有痕量待测物或干扰物时。
7. 校准曲线： 用于计算的校准曲线应建立在与样品分析相同的条件下，并具有良好的线性、准确度和精密度。
8. 内标使用： 对于存在显著基质效应的方法（尤其是色谱-质谱法），强烈推荐使用结构类似物或稳定同位素标记的内标物。内标应在样品前处理前加入，其回收率也可用于评估方法性能（虽然内标回收率评估目的与基质效应回收率略有不同）。计算基质效应时，内标峰面积比值有助于更准确判断。
9. 方法适用范围： 基质回收率结果通常只针对所测试的特定基质类型和制备方法。如果方法应用于新的基质类型，应重新进行基质干扰回收率评估。
10. 记录与报告： 详细记录所有实验步骤、使用的材料设备、加标浓度、平行次数、计算结果（每个样品的回收率、平均值、RSD%）、基质效应计算结果以及评估结论。

七、 结论

基质干扰回收率测定是评估分析方法在特定基质条件下准确性和可靠性的核心实验。通过科学严谨地设计实验（选择合适的空白基质、加标水平和足够平行数）、规范操作（确保前处理和分析条件一致）、准确计算并依据合理的标准进行评估，可以有效地识别和量化基质效应，为优化分析方法和确保检测数据的准确性提供关键依据。在方法建立、验证和应用过程中，均需重视并定期复核基质干扰回收率的表现。