酶活性参考品校正实验

发布时间：2025-07-02 11:01:26 阅读量：3 作者：生物检测中心

酶活性参考品校正实验完整指南

目的： 本实验旨在建立或验证实验室常规测量系统对特定酶活性检测的准确性，通过使用具有已知酶活性赋值（即参考值）、具备计量学溯源性（通常可追溯到国际标准物质或国际单位SI）的酶活性参考品进行校正或赋值验证，确保实验室检测结果的准确性和可比性。

原理： 酶活性参考品经过严格定值程序，其赋值具有较低的不确定度。通过使用该参考品在实验室常规检测系统（包括试剂、校准品、仪器、操作规程）上进行重复测定，可评估该常规系统的测量偏差。通过计算偏差（实测均值与参考值之差）或建立校正曲线，可将该偏差应用于后续的患者样本检测结果进行校正，或确认当前系统的准确性在可接受范围内。

适用范围： 适用于临床实验室、研究机构或质量控制部门使用的各类酶活性检测项目（如ALT、AST、LDH、ALP、GGT、CK、AMY等）的测量系统准确性验证、校正或参考区间确认。

试剂与材料：

  1. 酶活性参考品： 具有明确赋值（活性单位/U/L或kat/L等）及较小不确定度的冻干品或液体参考品。应持有有效的溯源性文件（如证书），注明定值方法、不确定度和有效期。注意： 使用前需严格按照说明书进行复溶（冻干品）和平衡至室温。
  2. 常规检测试剂盒： 实验室日常使用的、配套校准品的酶活性检测试剂盒。
  3. 常规校准品： 实验室日常使用的、与试剂盒配套的校准品（除非参考品将直接用于常规校准）。
  4. 质控品： 实验室常规使用的至少两个水平的质控品。
  5. 稀释液： 适用于该酶和基质的稀释液（如生理盐水、特定缓冲液等）。避免使用含有待测酶活性或抑制物的基质。
  6. 仪器： 实验室常规使用的全自动生化分析仪或分光光度计。
 

仪器设备：

  1. 精密移液器（单道、多道）。
  2. 微量加样枪头。
  3. 试管（如塑料反应杯或比色皿）。
  4. 漩涡混合器。
  5. 计时器。
  6. 恒温水浴箱（如仪器温控不可靠或使用分光光度计手动操作时）。
  7. 生化分析仪或分光光度计。
 

环境要求：

  1. 符合规范的实验室环境（温度、湿度控制）。
  2. 操作区域清洁无尘。
  3. 实验人员需具备相应资质并熟悉操作规程和安全规范。
 

操作步骤：

步骤一：实验前准备

  1. 熟悉参考品说明书： 仔细阅读酶活性参考品说明书，了解其赋值、不确定度、复溶方法、稳定性、储存条件、基质效应说明及推荐测量条件。
  2. 复溶与平衡（冻干品）：
    • 使用规定的、经检定合格的纯水（如一级水）或指定复溶液。
    • 严格按照说明书规定的体积和温度进行复溶。
    • 轻轻旋转或颠倒混匀，避免剧烈震荡产生气泡或导致蛋白质变性。
    • 复溶后在规定温度（通常室温20-25℃）下平衡规定时间（通常30分钟）。
  3. 试剂与校准品准备： 按照试剂盒和校准品说明书进行准备，确保在有效期内。
  4. 仪器准备：
    • 按照操作规程开启仪器，进行必要的维护保养（如清洁、检查光源、比色杯等）。
    • 预热仪器至工作温度（通常37℃），平衡至少30分钟。
    • （可选，但推荐） 使用配套校准品进行校准（如果参考品将用于验证赋值而非直接校正）。
  5. 质控品准备： 按照说明书准备常规质控品。
 

步骤二：确定实验方案

  1. 目标： 明确是进行赋值验证（确认常规系统测量值是否在参考品赋值的不确定度范围内）还是系统校正（需计算校正因子或偏移量）。
  2. 浓度点： 通常使用参考品说明书推荐或赋值对应的浓度点。如需覆盖临床范围，可使用参考品原液或按要求进行基质匹配稀释（使用与患者样本基质尽可能相近的稀释液）。
  3. 重复次数： 进行足够重复测量以可靠估计均值和不精密度（CV%）。推荐至少3批次（不同天），每批次至少重复测定2次（即总共至少6个数据点）。对于赋值验证，CLSI EP15等标准推荐5天内每天测定2次。
  4. 批次安排： 将参考品和常规质控品穿插在常规患者样本检测序列中运行，以模拟日常检测条件。
 

步骤三：样本检测

  1. 常规质控品检测： 在实验开始前和/或后，运行常规质控品，确保系统在控状态。
  2. 参考品检测： 将准备好的酶活性参考品（原液或稀释液）作为样本，在常规检测系统和条件下进行测定。
    • 记录每次测定的原始结果。
    • 确保每次测定过程符合标准操作规程（SOP）。
 

步骤四：数据处理与分析

  1. 数据整理： 记录所有重复测定的结果（仪器原始读数或计算出的酶活性值）。
  2. 计算统计量：
    • 均值 (Mean)： 计算所有重复测定结果的平均值 (Xobs)。
    • 标准差 (SD)： 计算所有重复测定结果的标准差。
    • 变异系数 (CV%)： CV% = (SD / Mean) * 100%。
  3. 赋值验证：
    • 获取参考品的赋值 (Xref) 及其扩展不确定度 (U)。
    • 计算实测均值与赋值之差：偏差 (Bias) = Xobs - Xref。
    • 计算偏差的相对值百分比：相对偏差 (%Bias) = (Bias / Xref) * 100%。
    • 判定： 验证 Xobs 是否落在 Xref ± U 的范围内（考虑标准不确定度时，常要求偏差在 ±U 内；或使用扩展不确定度 k=2 的区间）。若在范围内，表明常规系统测量值相对于参考值处于可接受的一致性水平。
  4. 系统校正（如偏差不可接受且需校正）：
    • 计算校正因子 (Correction Factor, CF)： CF = Xref / Xobs。
    • 计算偏移量 (Offset)： Offset = Xref - Xobs。
    • 应用校正：
      • 因子法： 随后患者样本的检测结果需乘以该校正因子 (结果校正后 = 结果原始 * CF)。
      • 偏移法： 随后患者样本的检测结果需加上该偏移量 (结果校正后 = 结果原始 + Offset)。注意偏移量与浓度相关性。
    • 重要说明： 校正通常意味着使用该参考品重新赋值给常规校准品或直接使用该参考品作为新的校准品进行校准。直接对患者样本结果进行数学运算可能不够理想且需谨慎评估基质效应。最佳实践是重新校准系统。
 

步骤五：不确定度评估（可选，但推荐）

  1. 评估本次测定结果总不确定度的主要来源：
    • 参考品赋值的不确定度 (u(ref))。
    • 测量重复性引入的不确定度 (u(rep) = SD / sqrt(n), n为总重复次数)。
    • 潜在基质效应或方法学差异引入的不确定度（评估较复杂）。
  2. 合成标准不确定度：u_c = sqrt[u(ref)^2 + u(rep)^2 + ...]。
  3. 扩展不确定度：U = k * u_c (k通常取2，对应95%置信水平)。
 

步骤六：结果报告

  1. 报告酶活性参考品的名称、批号、赋值、不确定度及溯源信息。
  2. 报告测定日期、仪器型号、试剂批号、校准品批号（如使用）。
  3. 报告所有原始测定结果。
  4. 报告计算的统计量：均值 (Xobs)、SD、CV%。
  5. 报告赋值验证结果：计算出的偏差 (Bias)、相对偏差 (%Bias)，并明确是否在 Xref ± U 的范围内。
  6. （如进行校正）报告计算的校正因子 (CF) 或偏移量 (Offset)。
  7. 报告任何观察到的异常情况或偏离标准操作的情况。
  8. （如计算）报告测量结果的合成标准不确定度 (u_c) 和扩展不确定度 (U)。
 

步骤七：后续步骤

  1. 赋值验证通过： 确认当前常规检测系统状态良好，常规校准有效。结果可直接用于临床或研究。
  2. 赋值验证未通过：
    • 排查原因： 检查仪器状态、试剂/校准品性能、操作流程、基质效应可能性等。
    • 重新验证： 解决问题后重新进行验证实验。
    • 系统校正： 如果偏差恒定且可接受，可考虑应用校正因子/偏移量（优先通过重新校准系统实现）。
    • 寻求支持： 联系试剂/仪器技术支持和参考品提供方的技术支持。
  3. 应用校正： 如决定校正，应更新SOP，记录校正因子/偏移量及其应用方法，并在校正后重新运行质控品和（有条件时）其他参考品或新鲜样本进行验证。
  4. 定期进行： 参考品校正/验证应纳入实验室质量管理体系，定期执行（如每更换试剂/校准品批号、主要仪器维护后、或按计划周期如每季度/半年）。
 

质量控制：

  1. 实验全程使用常规质控品监控系统稳定性。
  2. 严格遵守标准操作规程。
  3. 使用经过计量检定的移液器等设备。
  4. 记录实验环境条件（温度、湿度）。
  5. 实验结果需经过授权人员审核。
 

注意事项：

  1. 基质效应： 是酶活性参考品应用的关键挑战。务必了解参考品的基质（如人源血清、缓冲液等）是否与待测患者样本（血清/血浆）匹配。基质差异可能导致活性测量值的差异。
  2. 复溶准确性： 严格按说明书要求操作，确保复溶体积精准。
  3. 稳定性： 复溶后参考品需在规定条件和时间内使用。避免反复冻融（除非说明书允许）。
  4. 温育温度： 酶活性对温度敏感，确保仪器温控精确（如37.0±0.1℃）。
  5. 溯源性： 确保使用的参考品具有清晰有效的计量溯源性声明。
  6. 方法学差异： 不同检测方法（如底物、指示反应、测定条件）对酶活性的结果有直接影响。参考品的赋值是基于特定参考方法的，常规方法与之比较时，偏差可能部分来源于方法学差异本身（非系统误差）。需理解其含义。
  7. 数据解读： 偏差是否可接受需结合该项目的临床允许总误差 (TEa)、方法性能规范 (MPA) 以及不确定度来综合判断（参见CLIA、生物学变异等标准）。
 

参考文献：

  • ISO 15193: In vitro diagnostic medical devices — Measurement of quantities in samples of biological origin — Requirements for content and presentation of reference measurement procedures.
  • ISO 15194: In vitro diagnostic medical devices — Measurement of quantities in samples of biological origin — Requirements for certified reference materials and the content of supporting documentation.
  • ISO 15195: Laboratory medicine — Requirements for the competence of calibration laboratories using reference measurement procedures.
  • ISO/IEC 17025: General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
  • CLSI EP15-A3: User Verification of Precision and Estimation of Bias; Approved Guideline—Third Edition.
  • CLSI EP32-R: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline.
 

结论：

酶活性参考品校正实验是保证实验室酶活性检测结果准确、可靠和可比性的核心活动。通过严格遵循标准化的操作流程、关注关键影响因素（如基质效应、溯源性）、进行科学的统计分析（赋值验证、偏差/不确定度计算），并依据结果采取适当的措施（确认有效性或实施校正），可以有效提升检测质量，为临床诊断、治疗监测和科学研究提供可信赖的数据支撑。该过程应纳入实验室的常规质量保证计划并持续进行。