等温滴定量热法结合常数测定

发布时间：2025-07-02 09:43:48 阅读量：1 作者：生物检测中心

等温滴定量热法测定分子间相互作用的结合常数

引言

理解生物分子（如蛋白质、核酸、配体、药物、脂质体等）之间相互作用的强度和机制是现代生命科学、药物研发和材料科学的核心。结合常数（Ka，或其倒数解离常数 Kd）是量化这种相互作用亲和力的关键热力学参数。等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种无标记、直接、在溶液中进行的技术，能够通过一次实验同时测定结合常数（Ka）、结合焓变（ΔH）、化学计量比（n），并间接计算吉布斯自由能变化（ΔG）和熵变（ΔS），从而提供分子相互作用最完整的热力学图谱。

一、 ITC 基本原理与测量原理

  1. 核心概念： ITC 直接测量在恒定温度下，两种分子结合或反应时吸收或释放的热量（q）。这个热量变化直接反映了反应前后体系能量的变化，即焓变（ΔH）。
  2. 仪器核心组件：
    • 参比池： 通常装有溶剂或缓冲液，维持温度恒定。
    • 样品池： 装有待测分子之一（通常是受体分子，如蛋白质、DNA）。
    • 滴定注射系统： 精密的注射器，内含另一种分子（通常是配体分子，如小分子、药物、另一蛋白质）。
    • 高灵敏度温差检测器： 精密测量样品池与参比池之间的微小温差（低至百万分之一摄氏度）。
    • 反馈加热系统： 当注射配体引发结合反应，样品池温度若发生变化（放热反应温度上升，吸热反应温度下降），系统会立即施加相反方向的功率给样品池或参比池，使其温差恢复到零。
  3. 测量原理：
    • 在恒温（等温）条件下，将小体积的配体溶液逐步滴定到样品池中的受体溶液里。
    • 每次注入配体时：
      • 如果配体与受体发生结合，会伴随热效应（放热或吸热）。
      • 温差检测器探测到样品池与参比池的温差变化。
      • 反馈系统施加补偿功率（Power）到样品池（吸热时加热）或参比池（放热时加热参比池，相当于冷却样品池），以维持两池零温差。
    • 维持零温差所需的补偿功率值随时间变化的曲线被记录下来。这个功率值正比于结合反应在单位时间内释放或吸收的热流（dq/dt）。
    • 一次注入结束后，体系逐渐达到新的平衡状态，补偿功率最终回到基线水平。
    • 仪器软件对每次注入的功率-时间曲线进行积分，得到该次注入对应的总热量变化（ΔQ）。
    • 原始数据： 将每次注入的 ΔQ（微卡， μcal）对注入次数（或累计加入的配体摩尔数与受体摩尔数之比 [L]t/[M]t）作图，得到原始热谱图。
 

二、 ITC 实验流程

  1. 样品制备：
    • 纯度要求高： 受体和配体都需高纯度（最好 >95%），避免杂质干扰。
    • 缓冲液匹配： 受体溶液、配体溶液必须溶解在严格相同的缓冲液（pH、离子强度、添加剂、还原剂等）中。配体溶液通常使用受体溶液的透析液配制，这是至关重要的步骤，以消除稀释热和混合热的干扰。
    • 浓度优化： 受体浓度 ([M]) 通常设置在 10-100 μM 范围内，配体浓度 ([L]) 通常比受体浓度高 10-20 倍。目标是使滴定结束时 [L]t/[M]t 比值在 1-3 之间（取决于化学计量比 n），并且滴定曲线能覆盖从初始饱和结合到接近完全饱和的阶段。常用经验公式：c = n * [M] * Ka（c 值在 10-1000 范围内可得到可靠结果，10-500 较理想）。
    • 脱气： 所有溶液需充分脱气，避免气泡产生干扰信号和非特异热效应。
  2. 仪器准备：
    • 清洗样品池和注射器。
    • 恒温：设定精确的实验温度（通常 25°C 或 37°C，可根据研究体系选择）。
    • 基线稳定：注入缓冲液平衡系统，直至基线稳定。
  3. 装样：
    • 将精确体积的受体溶液加入样品池。
    • 将精确体积的配体溶液装入注射器。
  4. 滴定参数设置：
    • 总注射次数： 通常 15-30 次。
    • 单次注射体积： 根据浓度和目标 c 值调整。初始几次可设置较小体积（如 1-2 μL）以更精确地确定结合位点，后续可稍大（如 2-10 μL）。现代仪器也支持变体积注射。
    • 注射间隔时间： 足够长（通常 120-300 秒），确保每次注射后体系都能充分达到热平衡（信号回到基线）。搅拌速度需适中以保证混合均匀。
  5. 运行实验： 仪器自动执行滴定程序，记录每次注入过程的功率补偿-时间曲线。
  6. 对照实验：
    • 配体稀释热： 将配体溶液滴定到纯缓冲液中（不含受体）。测得的热量主要来源于配体的稀释热效应。
    • 受体稀释热： 将缓冲液滴定到受体溶液中。测得的热量主要来源于受体的稀释热效应（通常很小）。
    • 这些对照实验的热量需从原始数据中扣除，以得到纯的结合热效应。
 

三、 数据处理与结合常数计算

  1. 数据预处理：
    • 积分： 软件对每次注入的功率-时间曲线积分，得到该次注入的总热量（ΔQ）。
    • 稀释热扣除： 将扣除配体稀释热（和受体稀释热）校正后的每次注入的净热量（ΔQcorrected）作为有效数据点。
  2. 数据转换： 将 ΔQcorrected（单位：cal 或 J）转化为每摩尔注射配体所产生的热量（ΔQ/mol_inj），或更常用的是转化为每摩尔受体所产生的热量（ΔH_per_mol_M = ΔQcorrected / [M]t * V0，其中 [M]t 是样品池中受体的总浓度，V0 是样品池初始体积）。
  3. 拟合模型： 将校正后的净热量（ΔQ_per_mol_inj 或 ΔH_per_mol_M）对累计摩尔比（[L]t / [M]t）绘图，得到结合等温线。使用适当的数学模型（最常用的是单一结合位点模型）对数据进行非线性最小二乘拟合。
  4. 单一结合位点模型：
    • 模型假设： 一个受体分子（M）有一个完全相同的、独立的结合位点，与一个配体分子（L）结合形成复合物（ML）。反应为：M + L ⇌ ML
    • 关键拟合参数：
      • 结合常数： Ka = [ML] / ([M][L]) （单位 M⁻¹）。拟合直接得到 Ka。解离常数 Kd = 1 / Ka （单位 M）。
      • 摩尔结合焓： ΔH （单位 kcal/mol 或 kJ/mol），每次结合反应释放（负值）或吸收（正值）的热量。
      • 化学计量数： n，表示每个受体分子能结合多少个配体分子（通常接近 1）。
    • 拟合方程 (宏观)： 对于第 i 次注射，累计加入配体浓度为 [L]t,i，此时体系中游离配体浓度 [L] 和结合配体浓度 [ML] 满足：
      [ML] = ( [M]t + [L]t,i + 1/Ka - sqrt( ( [M]t + [L]t,i + 1/Ka )² - 4 * [M]t * [L]t,i ) ) / 2
      第 i 次注射产生的热量 Qcum,i (累计到第 i 次的总热量) 是：
      Qcum,i = ΔH * V0 * [ML]i
      第 i 次注射的净热量 ΔQi 是：
      ΔQi = Qcum,i - Qcum,i-1 + dilution_correction_i
      软件通过迭代计算 [L] 和 [ML]，调整 Ka, ΔH, n 的值，使模型计算的 ΔQi 与实验测得的 ΔQcorrected_i 的残差平方和最小。
  5. 热力学参数计算：
    • 吉布斯自由能变化： ΔG = -RT ln(Ka) = RT ln(Kd) （其中 R 是气体常数，T 是绝对温度）。ΔG 反映结合的自发性（ΔG < 0 自发）。
    • 熵变： ΔG = ΔH - TΔS => ΔS = (ΔH - ΔG) / T。熵变揭示了结合过程中体系有序度（负值）或无序度（正值）的变化。
    • 亲和力： Ka 值越大（或 Kd 值越小），表明亲和力越强。
 

四、 ITC 的应用优势

  1. 无需标记： 直接检测反应本身的热效应，无需对分子进行荧光、放射性等标记，避免干扰其天然结构和性质。
  2. 直接测量： 直接在溶液中进行，最接近生理状态（缓冲液条件可精确模拟生理环境）。直接测量ΔH。
  3. 全面参数： 一次实验即可获得结合常数（Ka/Kd）、化学计量比（n）、结合焓变（ΔH）、吉布斯自由能变化（ΔG）和熵变（ΔS）等全套热力学参数。这是ITC最核心的优势。
  4. 高灵敏度： 现代仪器灵敏度极高（可达纳卡级别），可测定低微摩尔甚至纳摩尔级别的结合常数。
  5. 适用范围广： 可用于研究几乎所有能在溶液中发生的生物分子相互作用（蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-小分子、核酸-小分子、蛋白质-脂质、酶-底物/抑制剂、离子结合、自组装等）。
 

五、 ITC 的局限性与挑战

  1. 样品浓度要求高： 需要相对较高的样品浓度（通常在微摩尔级别），对于溶解度低或难以大量获取的样品（如某些膜蛋白）是挑战。
  2. 样品纯度要求苛刻： 杂质产生的热信号会严重干扰数据的准确性和拟合质量。
  3. 缓冲液匹配至关重要： 缓冲液不匹配造成的稀释热会淹没小的结合热信号。质子化/去质子化效应（ΔHion）可能贡献显著（需在不同缓冲液中进行实验评估）。
  4. 热效应强度： 对于结合焓变（ΔH）非常弱（绝对值很小）的相互作用（特别是熵驱动型结合），检测灵敏度可能不足，信号可能被噪声或稀释热掩盖。
  5. 模型依赖： 拟合结果是基于所选模型得出的。对于复杂的结合模式（如多位点协同/非协同结合、弱非特异结合），需要选择更复杂的模型，增加了拟合难度和解释复杂度。需谨慎选择模型并结合其他方法验证。
  6. 数据解释： 获得 ΔH 和 ΔS 后，需要结合结构信息和其他生物物理数据来解释驱动结合的微观机制（如疏水作用、氢键、范德华力、构象变化等）。
 

六、 总结

等温滴定量热法（ITC）是研究溶液中分子相互作用的黄金标准技术。通过直接、无标记地测量结合反应的热量变化，ITC能够提供相互作用的完整热力学特征，包括结合常数（亲和力）、化学计量比、焓变、熵变和自由能变。这些参数对于理解相互作用的强度、特异性和驱动力（焓驱动 vs 熵驱动）至关重要，在基础生物化学研究、药物发现（先导化合物筛选与优化、靶点确认）、生物技术等领域具有不可替代的价值。尽管对样品纯度、浓度和缓冲液匹配有严格要求，其提供信息的全面性和直接性使其成为表征生物分子相互作用的强大且不可或缺的工具。

参考文献示例 （格式需统一，此处仅作概念性列举）

  • 等温滴定量热法原理与应用综述文献
  • 生物分子相互作用热力学研究经典文献
  • 权威的生物物理化学或生物化学方法学教材相关章节
  • 近年来ITC技术在特定领域（如药物发现、蛋白质工程）应用的高水平研究论文