抑制剂IC50值测定

发布时间：2025-07-02 09:01:31 阅读量：3 作者：生物检测中心

抑制剂IC50值测定：原理、方法与数据分析

一、 引言

在药物发现、生物化学和药理学研究中，抑制剂扮演着关键角色。评估抑制剂效力的核心指标是半最大抑制浓度，即IC50值。它定义为在特定实验条件下，能够抑制50%目标生物活性（如酶活性、受体结合、细胞增殖等）所需的抑制剂浓度。IC50值越小，表明抑制剂的效力越强。准确测定IC50值对于筛选先导化合物、优化药物结构、理解构效关系以及评估潜在药物的体外效力至关重要。

二、 基本原理

IC50测定基于抑制剂浓度与生物效应（抑制百分比）之间的剂量-反应关系。典型的剂量-反应曲线在抑制剂浓度对数坐标下呈S形（Sigmoidal）：

  1. 平台区： 在极低浓度下，抑制剂不足以产生显著抑制，抑制百分比接近0%。
  2. 上升区： 随着抑制剂浓度增加，抑制效应逐渐增强。
  3. 平台区： 在极高浓度下，抑制效应达到最大（通常接近100%），形成另一个平台。
  4. IC50点： 位于曲线上升部分的中间点，对应50%抑制效应。
 

通过拟合实验数据点到此S形曲线模型，即可精确计算出IC50值。

三、 实验方法

测定IC50值的方法多种多样，选择何种方法取决于研究的靶标性质和可用的检测技术。以下是几种常用方法的概述：

  1. 酶活性测定：

    • 原理： 直接测量抑制剂对目标酶催化其底物转化为产物速率的影响。
    • 常用技术：
      • 分光光度法： 检测产物/底物在特定波长下的吸光度变化（如NADH在340nm）。
      • 荧光法： 检测具有荧光特性的产物或使用荧光底物/探针（灵敏度通常更高）。
      • 发光法： 检测酶反应产生的光信号（如萤光素酶报告系统、ATP检测等，灵敏度极高）。
      • 放射分析法： 使用放射性同位素标记的底物，检测放射性产物的生成（传统方法，受安全限制）。
    • 流程：
      • 在含有固定浓度酶和底物的反应体系中，加入一系列不同浓度的抑制剂。
      • 在适宜条件下（温度、pH、时间）孵育反应。
      • 使用相应技术终止反应并检测信号（产物生成量或剩余底物量）。
      • 计算每个抑制剂浓度下的酶活性相对于无抑制剂对照（100%活性）的百分比。
      • 无抑制剂组代表0%抑制，通常设置不含酶或强抑制剂的组作为背景或100%抑制对照。

  2. 细胞增殖/活力测定：

    • 原理： 评估抑制剂对细胞生长或存活的影响（常用于抗肿瘤药物、抗病毒药物研究）。
    • 常用技术：
      • MTT/MTS/XTT法： 检测线粒体脱氢酶活性，将水溶性四唑盐还原为不溶/水溶性的甲臜染料（通过吸光度测量）。
      • CCK-8法： 类似MTT，使用水溶性染料，操作更简便。
      • SRB法： 检测细胞总蛋白含量（与细胞数量相关）。
      • ATP检测法： 检测细胞内的ATP含量（反映活细胞数量）。
      • 荧光染料法： 使用钙黄绿素-AM（活细胞荧光）或碘化丙啶（死细胞荧光）等染料区分活/死细胞。
    • 流程：
      • 将细胞接种于微孔板（如96孔板）。
      • 加入一系列不同浓度的抑制剂处理细胞。
      • 在特定条件下（通常37°C, 5% CO2）孵育一定时间（如24、48、72小时）。
      • 加入相应的检测试剂，孵育后测量信号（吸光度、荧光、发光）。
      • 计算每个抑制剂浓度下的细胞活力相对于未处理对照（100%活力）的百分比。

  3. 受体结合实验：

    • 原理： 评估抑制剂与特定受体竞争性结合已知配体（通常是放射性配体或荧光配体）的能力。
    • 常用技术： 放射配体结合分析、荧光偏振、时间分辨荧光能量共振转移、表面等离子体共振。
    • 流程：
      • 在含有固定浓度受体和标记配体的体系中，加入一系列浓度的抑制剂。
      • 孵育使结合达到平衡。
      • 分离结合配体与游离配体（如过滤、离心）。
      • 检测结合部分的信号（放射性计数、荧光强度）。
      • 计算每个抑制剂浓度下标记配体的特异性结合相对于无抑制剂对照（100%结合）的百分比。非特异性结合（有大量未标记配体存在下的结合）必须扣除。
 

四、 关键实验要素与注意事项

  1. 抑制剂浓度范围：

    • 浓度范围必须足够宽，以涵盖从几乎无抑制（<10%）到几乎完全抑制（>90%）的区域。通常设置8-12个浓度点。
    • 浓度点应按对数梯度均匀分布（如10μM, 3μM, 1μM, 0.3μM, 0.1μM...），以确保在S形曲线的关键区域（特别是IC50附近）有足够的数据点。
    • 初步实验（单点筛选）有助于确定合适的浓度范围起点。

  2. 剂量设置与稀释：

    • 通常从最高浓度储备液开始进行连续稀释。
    • 溶剂控制： 抑制剂通常溶解在有机溶剂（如DMSO）中。需确保每个反应孔（包括对照孔）中溶剂的终浓度完全一致（通常≤1% v/v），以避免溶剂本身对实验体系的干扰。设置仅含溶剂的对照孔至关重要。

  3. 对照设置：

    • 阳性对照 (100% 活性/活力/结合)： 不含抑制剂的反应体系（通常含等量溶剂）。
    • 阴性对照 (0% 活性/活力/结合 / 背景)：
      • 酶实验：不含酶或含有已知强效抑制剂使酶完全失活。
      • 细胞实验：不含细胞或加入高浓度杀细胞剂。
      • 结合实验：加入过量未标记配体以阻断特异性结合（测定非特异性结合）。
    • 空白对照： 仅含缓冲液/培养基，用于扣除背景信号（如测定体系本身的吸光度/荧光）。

  4. 实验重复：

    • 每个抑制剂浓度和所有对照设置都必须进行多次重复（通常 ≥3次独立重复），以获得可靠的平均值和标准差（SD）或标准误（SEM），并进行统计检验。
    • 重复可以是技术重复（同一次实验中的多个孔）和生物学重复（使用不同批次细胞或酶进行的独立实验）。生物学重复更能反映实验的可重复性。

  5. 体系优化：

    • 酶浓度/细胞数量： 应选择能产生足够强、稳定信号的浓度/数量，且反应处于线性期。
    • 底物浓度： 在酶学实验中，底物浓度通常选择在米氏常数（Km） 附近或低于Km（对竞争性抑制剂更敏感）。
    • 孵育时间： 确保反应到达稳态或平衡点（酶反应）或处理时间足够反映效应（细胞实验）。
 

五、 数据处理与IC50计算

  1. 数据归一化：

    • 计算每个抑制剂浓度下的原始信号值。
    • 扣除背景信号（空白对照平均值）。
    • 计算抑制百分比：
      抑制百分比 (%) = 100 * [1 - (信号样品 - 信号阴性对照) / (信号阳性对照 - 信号阴性对照)]
      • 信号样品：某抑制剂浓度下的信号（已扣除空白）。
      • 信号阴性对照：0%活性/活力/结合对照的信号平均值（已扣除空白）。
      • 信号阳性对照：100%活性/活力/结合对照的信号平均值（已扣除空白）。
    • 无抑制剂时，抑制百分比应为0%。高浓度抑制剂应接近100%抑制。

  2. 曲线拟合：

    • 将归一化后的数据（抑制百分比 vs 抑制剂浓度的对数）导入数据处理软件（如GraphPad Prism, Origin, R, SigmaPlot等）。
    • 使用非线性回归拟合一个四参数逻辑回归（Four-parameter logistic, 4PL）模型，也称为Hill方程：
      Y = Bottom + (Top - Bottom) / (1 + 10^((LogIC50 - X) * HillSlope))
      • Y：抑制百分比。
      • X：抑制剂浓度的对数（通常为log10[抑制剂]）。
      • Bottom：曲线下渐近线（通常固定为0%，对应完全无抑制）。
      • Top：曲线上渐近线（通常固定为100%，对应最大抑制）。
      • LogIC50：导致50%抑制时对应的抑制剂浓度的对数值（X值）。
      • HillSlope：曲线的斜率因子（Hill系数）。斜率=1表示符合标准质量作用定律（单一结合位点）；>1表示正协同；<1表示负协同或异质性。通常不固定，由软件拟合。
    • 软件会自动计算出最佳拟合曲线，并给出IC50值（10^LogIC50）及其95%置信区间（95% CI）。置信区间反映了估计值的不确定性，范围越窄越好。

  3. 结果报告：

    • 清晰报告测得的IC50值及其单位（通常是摩尔浓度，如 nM, μM）。
    • 必须包含95%置信区间。
    • 报告Hill系数（HillSlope）。
    • 报告使用的实验方法和关键条件（如酶浓度、底物浓度、细胞系、孵育时间等）。
    • 提供剂量-反应曲线图（抑制百分比 vs 抑制剂浓度对数），包含实验数据点、拟合曲线、IC50位置标注以及置信区间（可选）。
    • 说明实验重复次数（如n=3）。
 

六、 影响IC50值的因素与注意事项

  1. 实验条件： pH、温度、离子强度、反应时间、酶/细胞状态/批次等均可影响IC50值。严格标准化实验操作是保证结果可重复性和可比性的关键。
  2. 抑制剂稳定性： 抑制剂在实验条件下是否降解？需确认其稳定性或在实验中采取措施（如现配现用）。
  3. 溶剂效应： 如前所述，溶剂（尤其DMSO）的浓度和性质必须严格控制。
  4. 结合平衡： 在结合实验中，确保孵育时间足够长以达到结合平衡。
  5. 底物浓度： 对于竞争性抑制剂，IC50值会随底物浓度变化而变化（IC50 = Ki * (1 + [S]/Km)）。报告IC50时必须明确所用底物浓度。为了获得抑制常数Ki（与底物浓度无关），需要测定不同底物浓度下的IC50值或进行更复杂的动力学分析。
  6. 非特异性结合/抑制： 确保有效扣除背景和非特异性信号。
  7. 数据分析拟合： 确保选择的模型（4PL）合适，数据点分布良好（特别是IC50附近）。检查拟合优度指标（如R²）。避免外推。
  8. 机制复杂性： 如果抑制剂作用机制复杂（如变构抑制、不可逆抑制、存在多个结合位点），标准的4PL模型可能不完全适用，Hill系数会提供线索，可能需要更复杂的模型。
 

七、 总结

IC50值是评估抑制剂体外效力的基础且关键的量化指标。其准确测定依赖于精心设计的实验方案、严格控制的实验条件、合理的对照设置以及可靠的数据处理（特别是采用四参数逻辑模型进行非线性拟合）。深刻理解实验原理、关注关键影响因素并规范报告结果（尤其是IC50值及其置信区间、Hill系数和实验细节），对于获得可信、可比和有生物学意义的IC50数据至关重要。这些数据是推动药物研发和基础研究向前发展的基石。