蛋白质检测

蛋白质检测：技术与应用全景

蛋白质检测的意义何在？

蛋白质是生命活动的核心执行者，驱动着从细胞结构构建到信号传递、免疫防御等几乎所有关键生物过程。精准测定蛋白质的存在、丰度、结构及活性，构成了现代生命科学（疾病机制解析、药物靶点发现）、医学诊断（肿瘤标志物筛查、感染性疾病检测）、生物制药（药物纯度分析、效价评估）、食品安全（过敏原监控、营养成分分析）以及环境监测等众多领域的基石。

核心蛋白质检测技术体系

根据检测目标（总量、特定蛋白、活性、相互作用）和灵敏度需求，技术方案主要分为以下几类：

1. 基于蛋白质通用化学特性的总量测定（生化比色法）

   • 原理： 利用蛋白质共有化学基团（如肽键、特定氨基酸残基）与染料/试剂反应产生的颜色变化或吸光度变化进行定量。
   • 主流方法：
     • BCA法： 碱性条件下，蛋白质将Cu²⁺还原为Cu⁺，后者与BCA试剂形成稳定的紫色复合物，可在562nm检测。灵敏度高，抗干扰能力较强（尤其耐受去垢剂），操作简便。
     • Bradford法： 考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中结合蛋白质后，发生红移（最大吸收峰从465nm移至595nm）。快速、简便，但对去垢剂和强碱敏感。
     • Lowry法： 涉及两步反应（铜离子还原、福林酚试剂显色），灵敏度高于Bradford，但步骤繁琐，易受多种物质干扰。
     • 紫外吸收法（A280）： 利用蛋白质中色氨酸、酪氨酸在280nm的特征吸收。操作极简，无需试剂，但核酸污染会严重干扰结果。
   • 应用： 细胞/组织裂解液总蛋白定量、蛋白纯化过程各步骤收率计算、酶活性测定中的蛋白浓度标准化。

2. 基于抗原-抗体特异性识别的高灵敏靶向检测（免疫分析法）

   • 原理： 利用抗体对抗原（目标蛋白质）的高度特异性和强亲和力进行定性或定量分析。
   • 核心平台：
     • 酶联免疫吸附试验：
       • 直接ELISA： 酶标一抗直接结合包被抗原。
       • 间接ELISA： 一抗结合抗原后，再用酶标二抗检测一抗。最常用，信号放大效果好。
       • 夹心ELISA： 捕获抗体包被，捕获抗原后，再用检测抗体（常为酶标）识别抗原另一表位。灵敏度、特异性俱佳，需配对抗体。
       • 竞争ELISA： 样品抗原与固定抗原竞争结合有限量抗体。适用于小分子或只有单一表位的抗原。
     • Western Blotting（免疫印迹）：
       • 流程： 蛋白质样品经SDS-PAGE电泳按分子量分离 -> 转印至固相膜（PVDF/硝酸纤维素）-> 用特异性一抗孵育结合目标蛋白 -> 酶标或荧光标记二抗孵育 -> 化学发光/荧光/显色底物成像检测。
       • 优势： 可同时提供目标蛋白的分子量信息、相对表达量及特异性验证。
     • 免疫组织化学/免疫细胞化学： 在组织切片或细胞样本上利用抗体进行染色，通过显微镜观察目标蛋白的分布和定位（空间信息）。
     • 侧向层析/试纸条： 基于毛细作用，样品沿试纸条流动，抗原与标记抗体结合形成复合物，在检测线被捕获显色。快速（几分钟）、操作极简（如验孕棒）。
     • 免疫沉淀/免疫共沉淀： 利用抗体将目标蛋白及其相互作用蛋白从复杂混合物中“钓取”出来进行研究。
   • 应用： 血清/体液疾病标志物检测（如心肌肌钙蛋白）、病原体抗原筛查（如HIV p24）、信号通路蛋白表达分析、蛋白质相互作用研究、治疗性抗体药物检测。

3. 基于分子量精确测量的高分辨分析（质谱法）

   • 原理： 将蛋白质或多肽离子化，在电场/磁场中按质荷比（m/z）分离检测。
   • 典型流程：
     • 样品酶解（如胰蛋白酶）成肽段混合物。
     • 液相色谱分离肽段。
     • 质谱检测肽段分子量（一级质谱）及肽段碎裂后碎片离子（二级质谱/MS²）。
     • 数据库比对鉴定蛋白质及其翻译后修饰（磷酸化、糖基化等）。
   • 优势： 超高灵敏度、超高分辨率、可鉴定复杂混合物中成千上万种蛋白质并定量（如标记/非标记定量策略）、能解析复杂的翻译后修饰。
   • 应用： 蛋白质组学（大规模蛋白质鉴定与定量）、生物标志物发现与验证、蛋白质药物（如单抗）的精确表征（分子量、序列覆盖度、修饰位点）。

4. 基于活性检测的功能分析

   • 原理与方法：
     • 酶活性测定： 监测酶催化底物转化为产物的速率（常通过光吸收、荧光变化来追踪）。
     • 细胞功能实验： 基于蛋白质功能设计生物学实验（如报告基因检测信号通路活性、增殖/凋亡实验检测生长因子/凋亡蛋白功能）。
   • 意义： 直接反映蛋白质的生物学功能状态，对理解机制和药物筛选至关重要。

如何选择合适的检测方法？

• 检测目标是什么？ （总蛋白量？特定靶蛋白？未知蛋白？活性？）
• 灵敏度需求有多高？ （痕量 vs 常量）
• 特异性要求如何？ （区分目标蛋白与其他类似物或修饰形式）
• 样本类型和复杂性？ （血清？细胞裂解液？纯化蛋白？）
• 需要定量还是定性？半定量还是绝对定量？
• 是否需要空间定位信息？
• 是否需要分子量或修饰信息？
• 通量要求和检测速度？
• 设备、试剂成本及操作复杂性？

应用场景举隅

• 医学诊断： 血清甲胎蛋白（AFP）ELISA监测肝癌风险；C反应蛋白（CRP）免疫比浊法评估炎症；多种肿瘤标志物组合检测评估疗效与预后。
• 生物制药： BCA/Lowry法测定药物中间体总蛋白浓度；CE-SDS/HPLC-SEC分析抗体纯度与聚集；高分辨质谱表征抗体药物糖型结构与电荷异质性；ELISA/HCP检测宿主细胞残留蛋白。
• 基础研究： SDS-PAGE/WB分析基因干预后目标蛋白表达变化；免疫共沉淀探究蛋白互作网络；质谱蛋白质组学筛选疾病相关差异蛋白。
• 食品安全： ELISA/侧向层析试纸条快速筛查食品中过敏原（麸质、花生）；凯氏定氮法测定食品总蛋白含量（需注意非蛋白氮干扰）。
• 农业科学： 检测作物种子贮藏蛋白含量与品质。

未来发展方向

• 更高灵敏度与通量： 单分子检测技术、微流控芯片与质谱联用、多重检测技术（如质谱流式）。
• 原位与实时分析： 发展更精准的原位质谱、活细胞荧光成像探针。
• 人工智能赋能： AI辅助质谱数据解析、预测蛋白质结构与功能、优化实验设计。
• 集成化与自动化： 开发一体化、全自动的蛋白质分析工作站。
• 单细胞蛋白质组学： 深入解析细胞异质性。

结语

蛋白质检测技术体系日臻完善，从经典的生化比色到精密的质谱分析，为揭示生命奥秘、守护人类健康、保障产品质量提供了强大支撑。深刻理解不同技术的原理、优势、局限性与适用场景，是精准获取所需蛋白质信息、推动科学发现与应用落地的关键。随着技术持续创新与交叉融合，蛋白质检测能力将迈向更高维度的发展阶段。