抗菌剂对其他微生物杀灭试验

发布时间：2025-07-01 18:38:50 阅读量：4 作者：生物检测中心

抗菌剂对其他微生物杀灭试验：原理、方法与意义

一、引言

抗菌剂（包括消毒剂、防腐剂、灭菌剂等）广泛应用于医疗、公共卫生、食品加工、日常生活等领域，其核心目的是杀灭或抑制有害微生物的生长繁殖，阻断疾病传播途径，保障人类健康与产品安全。评价一种抗菌剂效力的核心手段之一便是进行规范的微生物杀灭试验（Microbicidal Efficacy Testing）。这类试验旨在模拟实际使用条件（或特定标准条件），定量评估抗菌剂在规定时间内杀灭特定目标微生物的能力。

二、试验目的与原理

  1. 核心目的：

    • 定量评价效力： 测定抗菌剂在规定浓度、接触时间、温度、有机物干扰等条件下，对特定微生物的杀灭率或杀灭对数值（Log Reduction）。
    • 比较不同产品/配方： 评估不同抗菌剂或同一抗菌剂不同配方、浓度、处理方式的效果差异。
    • 验证使用参数： 确定达到预期杀菌效果所需的最低有效浓度（MEC）或最短接触时间。
    • 支持产品注册与法规符合性： 为产品上市、标签标注（如“杀灭99.9%的XXX菌”）提供科学依据，满足相关国家标准、行业标准（如消毒技术规范）或国际标准（如AOAC, EN, ISO）的要求。
    • 质量控制： 监控生产批次间抗菌效力的稳定性。

  2. 基本原理：
    将特定种类和数量的微生物（试验菌）暴露于待测抗菌剂溶液中，经过预定接触时间后，立即采取有效措施终止杀菌作用（通常使用中和剂），然后对存活的微生物进行定量培养计数。通过比较处理组与对照组（未接触抗菌剂）的活菌数，计算杀灭率或杀灭对数值。

 

三、试验的核心要素

  1. 试验菌种的选择：

    • 代表性： 应选择与抗菌剂预期用途相关的、具有代表性的微生物，通常包括：
      • 细菌繁殖体： 革兰氏阳性菌（例如金黄色葡萄球菌）、革兰氏阴性菌（例如大肠杆菌、铜绿假单胞菌）。这是最基本的要求。
      • 真菌： 酵母菌（例如白色念珠菌）、霉菌（例如黑曲霉），用于评价抗真菌效果。
      • 分枝杆菌： （例如结核分枝杆菌的替代菌株龟分枝杆菌脓肿亚种），用于评价对最难杀灭的细菌繁殖体（亲脂病毒指示）和结核杆菌的效果。
      • 细菌芽孢： （例如枯草杆菌黑色变种芽孢、嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢），用于评价灭菌剂或高水平消毒剂的效果。
      • 病毒： （例如腺病毒、肠道病毒、包膜病毒如流感病毒等），需在特定病毒学实验室进行，评价抗病毒活性。
    • 标准菌株： 优先使用国际或国内标准菌种保藏中心提供的、特性明确的标准菌株。
    • 菌悬液制备： 试验菌需在适宜培养基中培养至稳定期（对数生长期后期），制备成浓度均一、分散性好的菌悬液，通常要求菌悬液浓度在10^8 – 10^9 CFU/mL范围。

  2. 抗菌剂样品：

    • 原液与使用液： 根据产品说明或试验设计，可能测试原液或按比例稀释的使用液。
    • 浓度： 需测试多个浓度（包括临界浓度）以评估剂量效应关系。常用几何级数稀释法。
    • 温度： 试验通常在室温（20±1°C）或产品指定温度下进行。温度对杀菌效果影响显著，需严格控制。

  3. 接触时间：

    • 设置多个时间点（例如30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、30分钟等），以观察杀菌动力学，确定达到预定杀灭效果所需的最短时间。

  4. 中和剂及其验证：

    • 作用： 在接触时间结束时，立即加入中和剂，迅速、完全地终止抗菌剂的持续杀菌作用，并且中和剂本身及其与抗菌剂的反应产物对微生物无毒、不影响其复苏生长。
    • 验证试验： 这是试验成败的关键步骤！必须通过验证试验证明：
      • 中和剂能有效中和抗菌剂残留活性。
      • 中和剂本身对试验菌无抑制或杀灭作用。
      • 中和剂与抗菌剂的混合物对试验菌无抑制或杀灭作用。
      • 残留的微量抗菌剂可被培养基充分稀释至无抑制浓度（若使用倾注法或涂布法）。
    • 常用中和剂： 如硫代硫酸钠（中和含氯、碘制剂）、卵磷脂+吐温80（中和季铵盐类、酚类、洗必泰等）、组氨酸（中和醛类）、甘氨酸（中和醛类）、D/E中和肉汤（广谱）等。

  5. 有机干扰物：

    • 模拟现实： 实际应用中，抗菌剂常接触血液、脓液、分泌物、食物残渣等有机物，这些物质会消耗有效成分或包裹微生物，降低杀菌效果。
    • 标准添加： 通常在试验体系中加入规定浓度的牛血清白蛋白（BSA）或酵母浸出粉溶液（如0.3% BSA或3%酵母），以模拟轻度或重度有机物干扰。

  6. 对照试验：

    • 阳性对照（菌数对照）： 仅含试验菌悬液和稀释液/中和剂（不含抗菌剂），用于确定试验体系中初始加入的活菌数（N0）。
    • 阴性对照（无菌试验/培养基无菌试验）： 仅含培养基或稀释液/中和剂（不含抗菌剂和试验菌），用于确认试验系统无菌。
    • 中和剂有效性对照： 含中和剂和试验菌（不含抗菌剂），确认中和剂无毒性。
    • 抗菌剂残留活性对照： 含抗菌剂和中和剂（不含试验菌），确认中和剂能有效中和抗菌剂。取样后加入试验菌，应能正常生长。
    • 稀释对照： 若采用稀释法消除残留抗菌剂（非中和法），需验证稀释倍数足够大，使残留浓度低于抑制水平。
 

四、常用试验方法

  1. 悬液定量杀菌试验（Suspension Test）：

    • 原理： 在试管或其它容器中，将定量的菌悬液加入定量的抗菌剂溶液中，混匀作用一定时间后，取混合液加入含中和剂的试管中（或直接接种到含中和剂的培养基中），培养计数存活菌落数。
    • 优点： 操作相对简单，微生物与抗菌剂接触充分，结果重现性好。是评价抗菌剂杀菌效力的基础方法。
    • 缺点： 模拟性稍差（微生物完全悬浮于溶液中）。
    • 适用： 评价消毒剂、防腐剂对微生物的杀灭效果，是许多标准方法（如AOAC, EN 1040, EN 1275）的核心。

  2. 载体定量杀菌试验（Carrier Test）：

    • 原理： 将定量的菌悬液滴加并干燥在无菌载体（如不锈钢片、玻璃片、聚四氟乙烯片、滤纸片、织物片等）上，制成染菌载体。将染菌载体浸入抗菌剂溶液中作用一定时间后，取出放入含中和剂的试管中（或直接放入含中和剂和玻璃珠的试管中震荡洗脱），洗脱液进行活菌计数。
    • 优点： 更贴近实际应用场景（微生物附着在物体表面）。
    • 缺点： 操作更复杂，载体材质、染菌量、干燥条件等影响因素多，结果重现性可能略低于悬液法。
    • 适用： 评价对硬/软表面、器械浸泡消毒效果的标准方法（如AOAC Hard Surface Carrier Test, EN 13697, EN 14561, EN 14562）。

  3. 定性试验（如酚系数试验）：

    • 通过比较待测消毒剂与标准酚在系列稀释度下对伤寒沙门氏菌的杀灭能力（表现为培养后是否浑浊），计算酚系数。此法较为古老，重现性差，现已较少作为主要评价方法，更多用于历史比较或特定要求。
 

五、结果计算与判定

  1. 存活菌数（N）： 抗菌剂作用后，经中和、培养计数得到的平均菌落数（CFU/mL或CFU/载体）。
  2. 初始菌数（N0）： 阳性对照组的平均菌落数。
  3. 杀灭率（Killing Rate, KR）：
    KR (%) = [(N0 - N) / N0] × 100%
  4. 杀灭对数值（Log Reduction Value, LRV）：
    LRV = Log10 N0 - Log10 N
    • 例如：N0 = 1.0 × 10^8 CFU/mL (Log10 N0 = 8.0)，N = 1.0 × 10^3 CFU/mL (Log10 N = 3.0)，则 LRV = 8.0 - 3.0 = 5.0。意味着抗菌剂使微生物数量降低了5个对数级（即杀灭了99.999%）。
  5. 结果判定：
    • 根据相关产品标准、法规要求或试验设计目标进行判定。常见要求例如：
      • 对细菌繁殖体：在指定条件下（如5分钟），LRV ≥ 5.0（即杀灭率≥99.999%）视为合格。
      • 对真菌：LRV ≥ 4.0（杀灭率≥99.99%）。
      • 对分枝杆菌：LRV ≥ 4.0（杀灭率≥99.99%）。
      • 对细菌芽孢：LRV ≥ 6.0（杀灭率≥99.9999%）常作为灭菌或高水平消毒的指标。
    • 试验通常需重复3次以上，计算平均值和标准差。
 

六、试验的关键影响因素与注意事项

  1. 中和剂验证： 如前所述，这是确保结果准确可靠的最关键环节，必须严格按标准进行验证。
  2. 微生物的状态与浓度： 菌龄、培养条件、菌悬液制备方法、初始浓度直接影响结果稳定性。需标准化操作。
  3. 温度控制： 温度波动会显著影响杀菌速度，需使用恒温水浴或培养箱精确控温。
  4. 接触时间精度： 作用时间需精确计时，尤其在短时间作用（如30秒）时。
  5. 混合均匀性： 在悬液法中，确保菌悬液与抗菌剂溶液快速充分混合至关重要。
  6. 有机物负荷： 添加的有机物浓度和类型应模拟实际应用场景，并明确标注。
  7. 水质： 配制抗菌剂稀释液、中和剂、培养基等应使用规定的纯水（如蒸馏水、去离子水）。
  8. 实验操作规范性： 无菌操作技术、移液精度、菌落计数准确性等直接影响结果。操作人员需经培训。
  9. 数据分析与报告： 完整记录原始数据、计算方法、试验条件（温度、时间、浓度、菌种、有机物负荷等）、所有对照结果，并清晰报告最终的平均杀灭率/LRV及其判定结论。
 

七、意义与应用

规范、严谨的抗菌剂微生物杀灭试验是：

  1. 科学评价的基础： 为抗菌剂的效力提供客观、可量化的科学证据。
  2. 产品研发与优化的指南： 指导配方调整、浓度确定和使用方法开发。
  3. 安全有效的保障： 确保产品在实际使用中能达到宣称的杀菌效果，有效控制感染风险。
  4. 市场准入的通行证： 满足国内外法规和标准要求，是产品注册、上市销售的必要条件。
  5. 质量控制的标尺： 用于监控生产一致性，保证每批产品的效力稳定。
  6. 使用者信心的来源： 通过清晰标注的、基于科学试验的杀菌效果，增强用户对产品的信任。
 

八、结论

抗菌剂对其他微生物杀灭试验是评估其效力的核心科学手段。试验设计需遵循标准化方法（如ISO, EN, AOAC, 国标等），严格控制试验菌种、抗菌剂浓度、接触时间、温度、有机物干扰、特别是中和剂有效性等关键因素。通过定量计算杀灭率或杀灭对数值（LRV），并依据相关标准进行判定，才能获得可靠、可重复的结果，为抗菌剂的合理应用、安全性评价、法规符合性以及最终保障公共卫生安全提供坚实的数据支撑。严谨的操作、完善的对照和详实的记录是试验成功的基础。