抗菌剂对大肠杆菌杀菌试验

发布时间：2025-07-01 18:29:21 阅读量：3 作者：生物检测中心

抗菌剂对大肠杆菌杀菌效力试验研究

摘要： 本研究系统评估了一种目标抗菌剂对大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922标准菌株的体外杀菌效力。通过定量悬浮试验，考察了不同作用浓度和作用时间对杀菌效果的动态影响。结果表明，该抗菌剂在特定浓度阈值以上表现出显著的浓度依赖和时间依赖杀菌效应，作用一定时间后可达到99.999%（5-log）以上的杀菌率。本研究为评估该抗菌剂的实际应用潜力提供了重要的体外实验数据支持。

关键词： 抗菌剂；杀菌效力；大肠杆菌；定量悬浮试验；最小杀菌浓度

1. 引言

大肠杆菌（Escherichia coli）作为革兰氏阴性杆菌的代表，是环境中广泛存在的条件致病菌，也是评估消毒剂和抗菌剂效力的常用指示微生物。其细胞结构（特别是外膜）对许多理化因子具有一定的抵抗力，因此常被用作验证产品杀菌效果的挑战菌株。有效控制环境中或物体表面的大肠杆菌污染，对预防交叉感染、保障公共卫生安全具有重要意义。

抗菌剂通过破坏微生物细胞结构（如细胞膜完整性）、干扰能量代谢、抑制蛋白质合成、损伤遗传物质等多种途径发挥杀菌作用。准确评价抗菌剂对特定微生物（如大肠杆菌）的杀菌效力，需要建立标准化的体外测试方法，以客观反映其在实际应用场景中的潜力。本研究采用国际广泛认可的定量悬浮试验方法，旨在科学评估目标抗菌剂对大肠杆菌标准菌株的杀灭效果及其浓度与时间依赖关系。

2. 材料与方法

  • 2.1 试验微生物: 大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 25922标准菌株。菌株复苏后，接种于营养肉汤中，37℃恒温震荡培养约18小时至对数生长期。
  • 2.2 抗菌剂: 目标抗菌剂（具体化学类别描述，如：含特定有效成分的溶液）。试验前用无菌磷酸盐缓冲液(PBS, 0.03 mol/L, pH 7.2 ± 0.2)稀释至一系列预设浓度梯度（例如：0.5%, 1.0%, 2.0%, 4.0%, 8.0% v/v 或 w/v）。
  • 2.3 中和剂: 经中和剂鉴定试验验证有效的溶液（例如：含特定浓度卵磷脂、聚山梨酯80、硫代硫酸钠、组氨酸等的溶液），用于立即终止抗菌剂的作用并中和其残留活性。中和剂本身及其与抗菌剂的混合物对试验菌应无抑制或杀灭作用，且对微生物生长无影响。
  • 2.4 培养基: 营养琼脂培养基，用于倾注法活菌计数。
  • 2.5 主要试剂: 无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，无菌生理盐水(0.85% NaCl)。
  • 2.6 主要仪器: 恒温培养箱，恒温水浴锅（或定时摇床），生物安全柜（II级），菌落计数器，移液器及无菌吸头，无菌试管、平皿等。
  • 2.7 试验方法：定量悬浮试验
    • 2.7.1 菌悬液制备： 取适量对数生长期菌液，离心（例如3000 rpm, 10 min），弃上清，用PBS洗涤菌体沉淀两次，最后用PBS重悬并调整菌液浓度至约1×10^8~1×10^9 CFU/mL（0.5麦氏浊度），作为试验用菌悬液。使用前进行梯度稀释和活菌计数验证初始浓度(N0)。
    • 2.7.2 暴露反应： 在无菌试管中，将1 mL目标抗菌剂测试溶液（不同浓度）与1 mL菌悬液迅速混合，立即启动计时（t=0）。将混合液置于设定温度（如20±1℃）的水浴锅中（或定时摇床）。对照组设置：阳性对照组（1 mL菌悬液 + 1 mL无菌PBS），阴性对照组（1 mL无菌PBS + 1 mL无菌PBS）。另设溶剂对照组（若抗菌剂含特殊溶剂）。
    • 2.7.3 作用时间点取样： 在预设的多个接触时间点（如0.5 min, 1 min, 2 min, 5 min, 10 min, 30 min），立即从反应管中取0.1 mL混合液，加入到9.9 mL预冷（4℃）的含中和剂的试管中，充分混匀，中和10分钟。设置多个平行样（通常n≥3）。
    • 2.7.4 活菌计数： 充分混匀中和后的溶液，进行适当的10倍系列梯度稀释（根据预期杀菌效果）。选取2~3个适宜稀释度，各取1 mL，用倾注法注入无菌平皿中，立即倾注约15 mL冷却至约45℃的营养琼脂，混匀凝固。同时设置阴性对照平皿（中和剂+培养基）以确保无菌。将平皿倒置于37℃恒温培养箱中培养48小时。
    • 2.7.5 菌落计数与计算： 计数各平皿上的菌落形成单位(CFU)。计算每个时间点、每个浓度的平均CFU/mL值(Nt)。
  • 2.8 数据处理：
    • 杀菌率(Kill Rate, KR): KR(%) = [(N0 - Nt) / N0] × 100%
      • N0: 阳性对照组混合液在t=0时刻（或经等效稀释后）的平均CFU/mL。
      • Nt: 抗菌剂处理组在接触时间t时的平均CFU/mL。
    • 杀菌对数值(Log Reduction, LR): LR = log10(N0) - log10(Nt)
    • 建立杀菌曲线： 以接触时间(t)为横坐标，LR值为纵坐标，绘制不同浓度抗菌剂的杀菌动力学曲线。
    • 最小杀菌浓度(MBC)： 定义为在特定作用时间（如24小时）后，能够杀死≥99.9%（3-log）初始接种菌量的最低抗菌剂浓度。通常通过时间点（如30分钟）定量悬浮试验结果推算或通过后续的亚培养法确定。
    • 统计学分析： 采用适当统计软件（如SPSS）进行数据分析和显著性检验（如t检验、方差分析），比较不同浓度、不同时间点杀菌效果的差异（通常设定P<0.05为差异显著）。
 

3. 结果

  • 3.1 初始菌量及对照组有效性： 阳性对照组初始菌量N0平均值为(XX ± YY) × 10^8 CFU/mL，符合试验要求（≥1×10^8 CFU/mL）。在各取样时间点，阳性对照组（仅PBS处理）的菌落数基本保持稳定（LR接近0），表明试验体系本身对细菌存活无显著影响。阴性对照组及中和剂对照组均无菌生长。
  • 3.2 杀菌动力学：
    • 目标抗菌剂对大肠杆菌ATCC 25922表现出显著的杀菌活性，其效力具有明确的浓度依赖性和时间依赖性。
    • 在较低浓度（如0.5%）下，杀菌速率较慢且最终杀菌率相对较低（如作用30分钟后LR<3-log）。
    • 随着抗菌剂浓度的增加，杀菌速率显著加快，达到高水平杀菌率（如LR≥5-log）所需时间明显缩短。
    • 在特定关键浓度（如≥2.0%）以上，抗菌剂展现出快速杀菌能力：
      • 在浓度C1（如2.0%）下，作用T1分钟（如5分钟）即可达到LR≥3-log（杀菌率≥99.9%）；作用T2分钟（如10分钟）可达到LR≥5-log（杀菌率≥99.999%）。
      • 在更高浓度C2（如4.0%）下，作用时间进一步缩短至T3分钟（如2分钟）即可达到LR≥5-log。
    • 图1展示了不同浓度抗菌剂作用下的杀菌动力学曲线（示例：曲线显示浓度越高、曲线下降斜率越大，达到高水平杀菌所需时间越短）。
  • 3.3 最小杀菌浓度(MBC)： 根据定量悬浮试验结果（30分钟作用），目标抗菌剂对大肠杆菌ATCC 25922的最小杀菌浓度(MBC)被确定为Z%（如1.0%），即在该浓度下作用30分钟可达到≥99.9%（3-log）的杀菌率。
 

4. 讨论

本研究通过标准化的定量悬浮试验，清晰揭示了目标抗菌剂对大肠杆菌标准菌株ATCC 25922的杀菌效能特征。实验结果明确证实了其杀菌效果的双重依赖性：杀菌速率和最终杀菌水平随抗菌剂浓度升高而显著增强（浓度依赖）；在固定浓度下，杀菌效果随接触时间延长而提升（时间依赖）。这一规律与其他类别有效抗菌剂的作用模式一致。

观察到在特定浓度阈值（如≥2.0%）以上时，该抗菌剂能够在较短时间内（如5-10分钟）实现对大肠杆菌的极高杀灭率（≥99.999%），达到高水平消毒的要求。其快速起效的特性对于实际应用中要求快速杀灭微生物的场景具有重要价值。所确定的MBC值可为制定最低有效使用浓度提供科学依据。

大肠杆菌的外膜结构是其抵抗部分抗菌物质的重要屏障。本研究所观察到的有效杀菌作用，提示该抗菌剂可能具备穿透革兰氏阴性菌外膜的能力，或者其作用机制能够有效破坏外膜完整性。确切的杀菌机制需通过进一步的机理研究（如细胞膜通透性变化、胞内物质泄漏、特定靶点研究等）加以阐明。

本试验在受控的实验室条件下进行，其结果反映了该抗菌剂的内在杀菌潜力。实际应用效果可能受到有机物负载（如血清、蛋白）、温度、pH值、表面材质等因素的影响。后续研究有必要模拟更接近真实世界的条件（如载体试验、有机物干扰试验）进行验证。此外，针对临床分离株或多重耐药菌株的敏感性测试也将丰富对该抗菌剂广谱活性的认识。

5. 结论

本研究证实，目标抗菌剂在体外对大肠杆菌标准菌株ATCC 25922具有显著的杀菌活性。其杀菌效果呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性。在达到或超过特定浓度（如2.0%）时，该抗菌剂能在较短时间内（如5-10分钟）实现高水平杀菌（≥99.999%）。最小杀菌浓度（MBC）测定结果为Z%（如1.0%）。这些体外数据为该抗菌剂在环境表面消毒、水处理或其他相关领域针对大肠杆菌污染控制的应用潜力提供了基础科学支持。未来的研究应关注其在复杂条件下的表现及具体的杀菌作用机理。

参考文献 (此处列举参考的相关标准和方法学文献，例如)

  1. GB/T 38502-2020 消毒剂实验室杀菌效果检验方法。
  2. A.O.A.C. International. Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. Chapter 6. Disinfectants.
  3. European Standard EN 1040:2005. Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of basic bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics - Test method and requirements (phase 1).
  4. European Standard EN 1276:2019. Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics used in food, industrial, domestic, and institutional areas - Test method and requirements (phase 2, step 1).
  5. McDonnell, G. E. (Ed.). (2007). Antisepsis, Disinfection, and Sterilization: Types, Action, and Resistance. ASM Press.
  6. Russell, A. D., Hugo, W. B., & Ayliffe, G. A. J. (Eds.). (2004). Principles and Practice of Disinfection, Preservation & Sterilization (4th ed.). Blackwell Science Ltd.
 

图/表说明：

  • 图1：不同浓度目标抗菌剂对大肠杆菌ATCC 25922的杀菌动力学曲线。 X轴：作用时间（分钟，对数刻度）；Y轴：杀菌对数值（Log Reduction）。不同曲线代表不同测试浓度（如：0.5%， 1.0%， 2.0%， 4.0%， 8.0%）。虚线标示3-log和5-log杀菌水平线。