抗菌剂抗真菌效力定性检测方法
1. 目的与适用范围
本方法旨在评估抗菌剂抑制或杀灭真菌（主要为酵母菌和霉菌）生长的定性能力（存在/不存在生长），适用于初步筛选抗菌剂配方、原材料或评价产品包装材料抗真菌污染性能。此方法提供“通过/失败”定性结果，不涉及精确的最低抑菌浓度（MIC）或杀灭动力学。
2. 检测原理
将一定浓度的抗菌剂样品（或经其处理的材料）与标准化真菌悬液接触作用规定时间后，接种于合适的固体培养基表面。在适宜真菌生长的条件下培养规定天数。通过肉眼观察培养基表面有无真菌菌落生长来判断抗菌剂是否具备抑制或杀灭供试真菌的效力。无生长判为“通过”（有抗真菌效力），有生长判为“失败”（无抗真菌效力或效力不足）。
3. 试剂与材料
- 供试菌种（推荐但不限于）：
- 酵母菌：白色念珠菌
- 霉菌：黑曲霉、巴西曲霉
- 注：可根据产品预期用途或特定风险选择其他相关真菌标准菌株。
- 培养基：
- 菌种保藏与活化： 沙氏葡萄糖琼脂斜面或马铃薯葡萄糖琼脂斜面。
- 试验用： 沙氏葡萄糖琼脂平板或马铃薯葡萄糖琼脂平板。
- 稀释液/中和剂：
- 磷酸盐缓冲液：用于稀释菌悬液及样品（如适用）。
- 中和剂（关键）：用于终止抗菌剂作用。选择取决于抗菌剂性质（如卵磷脂吐温80中和剂用于季铵盐类、酚类；硫代硫酸钠用于卤素类；甘氨酸用于醛类）。必须预先验证中和剂的有效性（能中和抗菌活性）和无毒性（不影响真菌生长）。
- 其他：
- 无菌生理盐水
- 无菌棉签或接种环
- 无菌移液管或微量移液器及无菌吸头
- 无菌试管
- 涡旋振荡器
- 恒温水浴锅（如需控制作用温度）
- 血细胞计数板或浊度计（用于菌悬液标准化）
- 恒温培养箱（通常设定为20-25°C，霉菌可能需要25-30°C）
- 生物安全柜（强烈推荐，II级）
4. 仪器与设备
- 生物安全柜（II级，强烈推荐，必需在无菌环境下操作）
- 恒温培养箱（可调控温度20-30°C及湿度）
- 高压蒸汽灭菌器
- 恒温水浴锅（精确控温±1°C）
- 涡旋振荡器
- 天平（精度0.001g）
- pH计
- 血细胞计数板及显微镜，或浊度计
- 微生物培养皿（无菌，90mm或100mm）
5. 实验步骤
5.1 实验前准备
- 培养基制备与灭菌： 按要求配制相应培养基，分装、灭菌（通常121°C，15分钟）。倾注无菌平皿，凝固后备用。使用前检查无菌性及表面干燥度。
- 稀释液/中和剂制备与灭菌： 按要求配制，过滤除菌或高压灭菌（视成分而定）。
- 仪器校准： 确保培养箱、水浴锅、pH计、天平等仪器经过校准并在有效期内。
- 生物安全确认： 在生物安全柜内进行所有涉及活菌的操作。穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜）。
5.2 菌悬液制备
- 菌种活化： 将冻存或斜面保藏的菌种接种至新鲜琼脂斜面，在适宜温度下培养足够时间（酵母菌通常24-48小时，霉菌5-7天或至形成丰富孢子）。
- 酵母菌悬液：
- 取适量无菌稀释液加入生长良好的新鲜斜面培养物中，用无菌棉签或接种环轻轻刮取菌苔。
- 转移至含玻璃珠的无菌试管中，涡旋振荡混匀。
- 静置片刻使大颗粒下沉，取上层均匀悬液。
- 用血细胞计数板或浊度计调整悬液浓度至约1×10^6 – 5×10^6 CFU/mL（菌落形成单位/毫升）。
- 霉菌孢子悬液：
- 向生长良好（产孢丰富）的斜面或平板培养物中加入适量含0.05%吐温80的无菌稀释液。
- 用无菌棉签或接种环轻轻刮取孢子。
- 转移至含玻璃珠的无菌试管中，涡旋振荡3-5分钟，充分打散孢子团块。
- 用无菌脱脂棉或滤膜过滤去除菌丝碎片。
- 用血细胞计数板调整孢子悬液浓度至约1×10^6 – 5×10^6 孢子/mL。
- 菌悬液验证： 立即取0.1mL最终菌悬液进行平板计数（倾注或涂布法），验证实际接种浓度（应在目标范围内）。
5.3 抗菌剂样品制备
- 液体样品： 可直接使用或按要求稀释（常用无菌缓冲液），确保测试浓度具有代表性。如需稀释，应尽快进行。
- 固体样品/材料：
- 直接接触法： 将无菌材料样品（如薄膜、颗粒）直接浸入菌悬液中作用。
- 洗脱法（间接法）： 用无菌稀释液浸泡或冲洗材料样品规定时间，收集洗脱液作为抗菌剂测试样品。需验证洗脱效率。
- 对照组设置：
- 阳性对照组： 不含抗菌剂的相应稀释液或材料洗脱液 + 菌悬液。必须生长良好。
- 中和剂对照组： 中和剂 + 菌悬液。必须生长良好，证明中和剂无毒。
- 阴性对照组： 仅中和剂 + 培养基。必须无菌，证明无菌操作和无菌试剂。
- 样品毒性/无菌对照组： 抗菌剂样品（或洗脱液） + 中和剂 + 培养基。必须无菌，证明样品本身不污染且中和后不抑制真菌生长。
5.4 抗菌剂-真菌作用
- 取适量（如1mL）制备好的抗菌剂测试样品（液体样品或洗脱液）加入无菌试管。
- 加入适量（如1mL）标准菌悬液（最终作用体系中菌浓度目标约为5×10^5 – 2.5×10^6 CFU/mL）。
- 立即涡旋混匀。开始计时。
- 将试管置于规定温度（通常20-25°C或产品使用温度）的水浴或培养箱中静置培养规定的作用时间（根据产品特性和测试目的设定，如5分钟、10分钟、30分钟、1小时、24小时等）。
- 作用时间结束时，立即加入足量（通常9mL或等体积）且已验证有效的中和剂到作用体系中。 充分涡旋混匀，终止抗菌作用。中和剂体积必须能确保有效中和。
- 对于固体材料（直接接触法）：
- 将无菌材料样品直接投入装有标准菌悬液的试管中作用规定时间。
- 作用结束后，立即将材料样品转移至装有足量中和剂的另一无菌试管中。
- 充分涡旋或震荡洗脱材料表面残留的真菌和抗菌剂。
- 此洗脱液用于后续接种。
5.5 接种与培养
- 取中和后的作用体系混合物（或固体材料的洗脱液）0.1mL（或推荐体积），分别接种于2个（或更多，依循证要求）预先标记好的固体培养基平板上。
- 立即用无菌涂布棒均匀涂布整个平板表面。
- 阳性对照组： 取0.1mL阳性对照混合液（不含抗菌剂），同样涂布2个平板。
- 中和剂对照组/样品毒性组： 按各自要求取液体涂布平板。
- 待接种物吸收后（可将平板正置放置片刻），将平板倒置放入设定好温度（酵母菌通常20-25°C，霉菌通常25-30°C）的培养箱中。
- 培养规定天数（通常酵母菌培养24-48小时，霉菌培养3-7天，或直至阳性对照生长良好）。
5.6 结果观察与判读
- 在规定的培养时间结束后，取出平板。
- 在良好光源下（必要时使用放大镜），肉眼观察每个平板表面是否有真菌菌落生长。
- 记录：
- 清晰记录每个平板的生长情况（有菌落/无菌落）。
- 描述菌落形态、颜色、数量（虽为定性，粗略计数有助于判断）。
- 拍照留存（推荐）。
- 结果判读标准：
- 阳性对照组： 必须 有大量典型菌落生长。否则试验无效，需重做。
- 中和剂对照组/样品毒性组/阴性对照组： 必须 符合相应要求（见5.3）。否则试验无效，需排查原因重做。
- 抗菌剂测试样品组（每个菌种）： 若其对应的所有平板在观察期结束时均无任何可见真菌菌落生长，则判定该抗菌剂在此测试条件下对该菌种“通过”（显示抗真菌效力）。若其对应的平板中有任何平板出现可见真菌菌落生长，则判定“失败”（在此条件下未显示足够抗真菌效力）。
6. 报告
试验报告应至少包含以下信息：
- 检测依据（如参考本方法或其他标准编号）。
- 供试抗菌剂样品描述（类型、状态、浓度/处理方法等，无企业名）。
- 使用的标准真菌菌种名称及编号。
- 菌悬液制备方法及最终接种浓度验证结果。
- 使用的培养基名称。
- 使用的中和剂名称及其有效性/无毒性验证简述。
- 抗菌剂-真菌作用条件（温度、时间）。
- 培养条件（温度、时间）。
- 所有对照组的详细结果（必须符合要求）。
- 抗菌剂测试样品对每种供试真菌的检测结果（通过/失败）。
- 试验日期、操作人员、环境条件（如适用）。
- 任何偏离本方法的说明。
7. 质量控制与注意事项
- 无菌操作： 所有步骤必须在无菌条件下（生物安全柜）进行，严格防止外源污染。
- 菌种活性与纯度： 使用新鲜活化的标准菌株，确保无杂菌污染。定期转种保藏。
- 菌悬液浓度准确性： 必须进行标准化并验证。浓度过高可能导致假阴性（低估效力），过低可能导致假阳性（高估效力）。
- 中和剂验证： 这是方法成功的关键。必须证明其在试验条件下能立即完全中和抗菌活性，且自身对真菌生长无抑制或促进作用。
- 作用时间控制： 加入菌液开始计时，加入中和剂结束计时，务必精确。
- 混匀： 各步骤加入液体后需充分混匀，确保接触均匀。
- 培养条件： 确保培养箱温度、湿度准确稳定。霉菌培养需注意保持一定湿度防止平板干燥。
- 观察： 需由有经验的人员在规定时间仔细检查平板，特别是霉菌菌落可能较小或扩散生长。
- 生物安全： 严格遵守微生物实验室安全规范，特别是操作霉菌孢子时需在生物安全柜中进行，防止气溶胶扩散。废弃物按生物危害废物处理。
- 方法局限性： 此为定性方法，仅能判断抗菌剂在特定条件下是否有效。如需定量数据（如MIC, MFC）或时间-杀灭曲线，需采用其他定量方法。结果受实验条件（温度、时间、培养基、中和剂、接种量等）影响显著。
- 方法适用性确认： 对于新型或特殊抗菌剂，建议在使用该方法前进行必要的方法学验证。
8. 方法验证（推荐）
对于关键或新的应用，建议定期或首次使用时进行方法验证：
- 重现性： 同一样品在同一实验室内由不同操作人员或在不同时间重复试验，结果应一致。
- 系统适用性： 使用已知效力的标准抗菌剂对照样品进行测试，结果应与其预期效力一致（如阳性对照生长，阴性无菌；特定浓度的标准抗菌剂应通过或不通过）。
遵循以上方法，可在实验室条件下对抗菌剂的抗真菌效力进行初步的定性评估，为产品开发、筛选和质量控制提供依据。