抗菌剂中大肠杆菌群检测技术规范
一、 前言
大肠杆菌群（Coliform bacteria）是一类需氧及兼性厌氧、在37℃生长时能使乳糖发酵、在24～48小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称。其主要成员包括埃希氏菌属（主要为大肠埃希氏菌）、克雷伯氏菌属、肠杆菌属等。该菌群主要来源于人和温血动物的粪便，作为粪便污染指示菌，其检出情况直接反映产品的卫生学质量及生产过程的卫生控制水平。
在抗菌剂（包括消毒剂、抑菌剂等）产品中检测大肠杆菌群具有特殊意义：
- 卫生质量监控：确保产品本身在生产、包装、储运过程中未受到粪便污染，保障使用者安全。
- 效力验证干扰排除：在评价抗菌剂对特定致病微生物杀灭或抑制效果时，产品本底存在的微生物（尤其是指示菌）会影响结果判读，需确保其无菌或低于规定限值。
- 法规符合性：国内外相关法规标准（如消毒产品卫生安全评价要求）普遍将大肠杆菌群作为关键卫生指标进行限定。
二、 检测原理
基于大肠杆菌群的生理生化特性（37℃发酵乳糖产酸产气），采用多管发酵法（MPN法） 进行定量检测。MPN法是一种统计概率方法，通过将样品系列稀释后接种于特定液体培养基（如乳糖胆盐发酵管），观察产气情况，再结合确证试验，估算样品中大肠杆菌群的最可能数量（Most Probable Number）。
三、 主要试剂与培养基
- 稀释液（如磷酸盐缓冲液/PBS, 0.85%生理盐水）：用于样品稀释。
- 中和剂溶液：至关重要！ 用于中和抗菌剂样品的残留抗菌活性，确保检测结果反映真实微生物污染而非抑菌效果。选择依据抗菌剂有效成分：
- 卵磷脂-吐温80中和剂：广谱中和剂，适用于季铵盐类（苯扎氯铵等）、酚类、洗必泰、醇类等。
- 硫代硫酸钠中和剂：适用于含氯消毒剂（次氯酸钠、二氧化氯等）、含碘消毒剂（碘伏）。
- 甘氨酸中和剂：适用于醛类消毒剂（甲醛、戊二醛）。
- 亚硫酸氢钠中和剂：适用于汞类防腐剂。
- 组氨酸中和剂：适用于含碘消毒剂的补充中和。
- D/E中和肉汤/中和剂：商品化广谱中和培养基。
- 选择原则：预先进行中和剂有效性验证（见质量控制部分）。
- 乳糖胆盐发酵管（单料与双料）：基础分离培养基，含乳糖、胆盐（抑制革兰氏阳性菌）、溴甲酚紫指示剂（产酸变黄）。
- 伊红美蓝琼脂（EMB琼脂）或麦康凯琼脂（MAC琼脂）：用于分离培养和初步鉴定。大肠杆菌群在EMB上典型菌落为紫黑色或中心紫黑色有或无金属光泽；在MAC上为粉红色菌落。
- 乳糖发酵管：含小倒管，用于产气确证。
- 革兰氏染色试剂。
- 蛋白胨水、靛基质试剂（柯凡克试剂）：用于靛基质试验（I）。大肠埃希氏菌通常I(+)。
- 其他生化试剂（可选，用于进一步鉴定）：如甲基红试剂(MR)、V-P试剂(VP)、柠檬酸盐利用试验等。
四、 仪器设备
- 无菌操作台（生物安全柜）。
- 恒温培养箱（36℃±1℃）。
- 恒温水浴箱（44.5℃±0.5℃）。
- 均质器或无菌研钵。
- 漩涡混合器。
- 天平（精度0.01g）。
- 无菌吸管（1mL, 10mL）、微量移液器及无菌吸头。
- 无菌培养皿。
- 无菌试管及试管架。
- 显微镜。
- 高压蒸汽灭菌器。
- pH计。
五、 检测步骤
核心要点：有效中和抗菌活性是成功检测的关键。
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样品前处理与中和：
- 液体样品：准确量取一定体积（如10mL）样品，加入含有足量（通常9倍体积）预选中和剂溶液的无菌容器中。充分混匀（漩涡混合），使其充分接触中和。此混合液即为1:10的样品稀释液。
- 固体/半固体/膏状样品：无菌称取一定量（如10g）样品，加入含有90mL预选中和剂溶液及适量玻璃珠的无菌均质袋或均质瓶中。用均质器充分拍打或振荡（如4000-8000r/min， 1-2分钟）使其乳化均质。此混合液即为1:10的样品稀释液。
- 注意：中和剂的选择和浓度必须经过验证确保能充分中和样品抗菌活性且对微生物无毒害。中和时间通常为5-10分钟。
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梯度稀释：
- 取1:10样品稀释液1mL或10mL，加入装有9mL或90mL无菌中和剂溶液（或生理盐水/PBS）的试管或瓶中，充分混匀，制成1:100稀释液。
- 依此类推，根据需要制备更高稀释度（如1:1000, 1:10000等）。每次稀释需更换吸管或吸头。
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初发酵（推测试验）：
- 选择3个适宜稀释度（通常根据样品预估污染情况选择，如1:10, 1:100, 1:1000）。
- 每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管。
- 对于1:10稀释液，接种10mL样品稀释液于10mL双料乳糖胆盐发酵管中。
- 对于≥1:100稀释液，接种1mL样品稀释液于10mL单料乳糖胆盐发酵管中。
- 将接种后的发酵管置于36℃±1℃恒温培养箱中，培养24±2小时。
- 观察记录：培养后检查各发酵管。凡发酵管内培养基变黄（产酸）并且小倒管内有气泡（产气），记录为阳性管（+）；培养基未变黄或虽变黄但小倒管内无气泡，记录为阴性管（-）。
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复发酵（确证试验）：
- 将所有产酸产气的初发酵阳性管，用无菌接种环分别划线接种于EMB琼脂平板或MAC琼脂平板上。
- 将平板置于36℃±1℃培养箱中，培养18～24小时（EMB）或24～48小时（MAC）。
- 观察记录：挑取平板上符合大肠杆菌群典型形态特征的菌落（EMB：紫黑色或中心紫黑色有或无金属光泽；MAC：粉红色菌落），每个平板至少挑取2个以上可疑菌落进行革兰氏染色镜检和乳糖复发酵试验。
- 革兰氏染色镜检：可疑菌落涂片，革兰氏染色，镜检。大肠杆菌群应为革兰氏阴性、无芽孢的短杆菌。
- 乳糖复发酵试验：将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落，接种于乳糖发酵管中（内有小倒管）。同时接种蛋白胨水（用于靛基质试验）。将乳糖发酵管置于44.5℃±0.5℃恒温水浴箱或培养箱中，培养24±2小时（水浴箱需水面高于管内液面）。
- 观察记录：培养后，若乳糖发酵管产酸（培养基变黄）产气（小倒管内有气泡），即判定为大肠杆菌群阳性（确证为粪大肠菌群或耐热大肠菌群）。记录阳性管数。同时进行靛基质试验（I），有助于鉴定是否为大肠埃希氏菌。
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结果计算（MPN法）：
- 根据初发酵试验中三个稀释度各自的阳性管数，查阅专用的MPN检索表。
- 表中查得的MPN值乘以相应的稀释倍数（通常以样品原液计），即为每克（g）或每毫升（mL）样品中大肠杆菌群的最可能数（MPN/g或MPN/mL）。
- 示例：若接种稀释度为1:10（10mL双料）、1:100（1mL单料）、1:1000（1mL单料）各3管，阳性管数分别为3, 1, 0。查MPN表（如0.1g/mL, 0.01g/mL, 0.001g/mL对应的阳性管数3-1-0）对应的MPN值为15。则该样品大肠杆菌群含量为：15 MPN/mL（液体）/ 15 MPN/g（固体）。（注意：MPN表设计对应的是接种量克或毫升数，计算时需明确）。
六、 质量控制与注意事项
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中和剂有效性验证（必须进行）：
- 试验组：样品 + 中和剂 + 定量已知活菌（常用铜绿假单胞菌ATCC 15442或大肠埃希氏菌ATCC 25922）悬液 → 混合作用后培养 → 回收菌量应接近初始加入量（回收率≥70%）。
- 中和剂毒性组：中和剂 + 定量已知活菌悬液 → 培养 → 回收菌量应接近初始加入量（证明中和剂无毒）。
- 中和产物毒性组：样品与中和剂混合物（预先反应）+ 定量已知活菌悬液 → 培养 → 回收菌量应接近初始加入量（证明中和产物无毒）。
- 阳性对照组：不加样品和中和剂，只加定量菌悬液 → 培养 → 应生长良好。
- 样品抑菌性组：样品 + 定量已知活菌悬液（无中和剂）→ 培养 → 应无菌生长或显著减少（证明样品有抑菌性）。
- 只有试验组回收合格且其他对照组结果符合预期，才证明该中和剂适用于此样品。
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无菌操作：整个实验过程必须严格执行无菌操作规程，避免环境或操作引入污染。
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培养基质量控制：新配制或购进的培养基需进行无菌检查（36℃培养24小时无生长）和性能检查（用标准菌株验证生长及典型反应）。
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培养温度与时间：严格控制初发酵（36℃）、复发酵（44.5℃）的温度和培养时间，这是结果判定的关键。
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阴性/阳性对照：
- 阴性对照：每次试验应设立稀释液+培养基的阴性对照管/平板，培养后应无菌生长。
- 阳性对照：使用大肠埃希氏菌标准菌株（如ATCC 25922）接种于培养基中作为阳性对照，应呈现预期的阳性反应（产酸产气、典型菌落、革兰氏阴性）。
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稀释与转移：稀释要准确，梯度间要充分混匀。转移样品液时，吸管或吸头不得接触稀释液液面以上容器内壁。高稀释度样品应在稀释后尽快接种。
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结果判读：复发酵（44.5℃乳糖产酸产气）是确证粪大肠菌群的关键步骤，必须严格执行。
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废弃物处理：所有含菌材料（培养基、平板、试管等）必须先经121℃高压蒸汽灭菌≥30分钟后方可丢弃。
七、 结果报告
报告内容应至少包括：
- 样品信息（编号、名称、性状、批号等）。
- 检测依据的标准方法（可注明参考GB 15979等通用标准原则）。
- 检测项目：大肠杆菌群（或注明粪大肠菌群）。
- 检测结果：以MPN/g或MPN/mL表示，并注明检测方法（如多管发酵法-MPN法）。
- 检测日期。
- 检测人员/实验室签章。
- 如有必要，可注明所用中和剂类型（如“采用卵磷脂-吐温80复合中和剂”）。
八、 结论
建立规范、可靠的抗菌剂中大肠杆菌群检测方法，核心在于有效中和其抗菌活性，并严格遵循无菌操作、培养基质控、规范培养与精确判读等步骤。通过多管发酵法（MPN法），结合确证试验，能够准确地定量检测抗菌剂产品中大肠杆菌群的污染水平，为评估产品的卫生质量、满足法规要求以及保障使用安全提供科学依据。持续进行严格的质量控制，特别是中和剂有效性验证和对照试验，是确保检测结果准确性的基石。