抗菌剂真菌菌落总数检测

抗菌剂真菌菌落总数检测方法

目的： 本方法旨在规范测定抗菌剂处理后残留的真菌（含酵母菌和霉菌）活菌总数，客观评价其抑制或杀灭真菌类微生物的整体效果。

原理：
将经抗菌剂处理后并中和残余效力的样品，以适宜的培养基（如沙氏葡萄糖琼脂）在特定温度下进行培养，使样品中存活的真菌孢子及菌体细胞得以生长繁殖，形成肉眼可见的菌落。通过统计菌落数量，计算单位样品中的真菌菌落总数（CFU/g 或 CFU/mL）。

试剂与材料：

1. 稀释液： 无菌磷酸盐缓冲液（PBS，0.03 mol/L, pH 7.2 ± 0.2）或生理盐水（0.85% - 0.90% NaCl）。
2. 中和剂： 根据待测抗菌剂特性选择，并经中和效果验证试验确认有效（如：吐温80、卵磷脂、硫代硫酸钠、组氨酸、甘氨酸等，或复合中和剂）。
3. 培养基： 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。
4. 阳性对照菌种： 白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231，黑曲霉菌（Aspergillus niger）ATCC 16404 或其他适用标准菌株。
5. 无菌器材： 无菌平皿、无菌移液器及吸头（1 mL, 10 mL）、无菌锥形瓶（带玻璃珠）、无菌试管、无菌涂布棒或L棒、无菌采样拭子（如适用）、无菌均质袋及均质器（如适用）、无菌镊子、酒精灯。
6. 主要仪器： 恒温培养箱（20-25°C及28-30°C）、恒温水浴锅（46±1°C）、生物安全柜或超净工作台、菌落计数器或自动计数仪、天平（精度0.01 g）、pH计、高压蒸汽灭菌锅、冰箱（2-8°C）。

操作步骤：

1. 准备工作：

   • 所有玻璃器皿、培养基、稀释液在121°C下高压灭菌15分钟以上。
   • 在无菌环境下制备培养基，倾注平皿（约15-20 mL/皿），冷却凝固。平板干燥或冷藏备用（使用前恢复至室温）。
   • 配制并验证中和剂的有效性及对微生物无毒副性（需进行中和剂鉴定试验）。
   • 阳性对照菌准备：取适量标准菌株新鲜培养物，用无菌稀释液制成均匀悬液（浓度约10^8 CFU/mL）。

2. 样品处理与稀释：

   • 液体样品： 无菌操作取适量样品（如10 mL或10 g）加入含90 mL无菌稀释液（预加适量中和剂）的锥形瓶中（带玻璃珠），充分振摇或均质（建议200 rpm振荡30分钟或拍击均质2分钟），制成1:10的初始样品匀液。
   • 固体或半固体样品： 无菌操作称取25 g样品，加入含225 mL无菌稀释液（预加中和剂）的均质袋中，拍击均质1-2分钟（或置带玻璃珠锥形瓶内充分振摇），制成1:10初始匀液。
   • 连续稀释： 用无菌吸管吸取1:10匀液1 mL，注入含9 mL无菌稀释液（含中和剂）的试管中，充分混匀，制成1:100匀液。依此进行10倍系列稀释（如1:1000, 1:10000等），直至获得预期含菌量的稀释度。每次更换吸头或充分灼烧吸管。

3. 中和作用：

   • 在稀释过程中所使用的稀释液必须含有经确认有效的中和剂，以中和抗菌剂的残留活性。
   • 样品匀液在含中和剂的稀释液中作用时间应保持一致（如室温下放置10分钟）。

4. 接种与培养：

   • 倾注平板法（推荐）：
     • 选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（预期菌落数30-300 CFU/皿）。
     • 无菌操作吸取1 mL样液至无菌平皿中。
     • 将冷却至46±1°C的融化沙氏葡萄糖琼脂培养基倾注入平皿（每皿约15-20 mL），立即小心旋转平皿，使样液与培养基充分混匀。待琼脂凝固。
   • 涂布平板法：
     • 选择2-3个适宜稀释度样品匀液。
     • 无菌操作吸取0.1 mL样液滴加至已凝固的沙氏葡萄糖琼脂平板表面。
     • 用无菌涂布棒或L棒将样液均匀涂布于整个平板表面。注意避免触及边缘。
   • 培养：
     • 将接种好的平板倒置于恒温培养箱中。
     • 酵母菌计数： 于28-30°C培养48±2小时。
     • 霉菌计数： 于20-25°C培养5-7天（需逐日观察菌落生长情况）。
     • 注：若样品中可能同时存在酵母菌和霉菌，可同时设置上述两种培养条件进行培养计数。

5. 阳性对照：

   • 取适量阳性对照菌稀释液（浓度约10^2 - 10^3 CFU/mL），按上述倾注或涂布法操作，同条件培养。
   • 确保平板生长良好菌落，验证试验条件适宜。

6. 空白对照：

   • 稀释液对照： 取1 mL含中和剂的稀释液加入平皿，倾注培养基，培养。
   • 培养基对照： 取未接种的空白平板培养。
   • 所有空白对照均应无菌落生长。

菌落计数与报告：

1. 计数：

   • 培养结束后，立即进行菌落计数。
   • 选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数。若有链状菌落，应计为一个菌落。
   • 霉菌菌落有时蔓延生长覆盖整个平板，应在早期（如第3、5天）标记观察，最终计数时若无法区分单个菌落，应报告为“蔓延生长”并注明稀释度。
   • 使用菌落计数器计数或在适宜光源下肉眼观察计数。必要时用放大镜。
   • 同一稀释度至少做两个平行平板。

2. 计算：

   • 倾注平板法（1 mL样品）：
     • 菌落总数(CFU/g or mL) = 平均菌落数 × 稀释倍数
   • 涂布平板法（0.1 mL样品）：
     • 菌落总数(CFU/g or mL) = 平均菌落数 × 稀释倍数 × 10
   • 示例：
   • 样品经1:1000稀释（10^-3），倾注法接种1 mL，两平板菌落数为65和73。
   • 平均菌落数 = (65 + 73) / 2 = 69
   • 菌落总数 = 69 CFU/平板 × 10^3（稀释倍数）= 6.9 × 10^4 CFU/g 或 mL
   • 多个稀释度计数： 若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30-300 CFU之间，应计算各稀释度结果并报告其几何平均值或按标准规定的规则取舍（如仅报告最高稀释度结果）。

3. 结果报告：

   • 报告每克（或每毫升）样品中的真菌菌落总数（CFU/g 或 CFU/mL）。
   • 结果宜表示为1.0 × 10^X CFU/g (mL)的形式（X为整数）。
   • 若所有平板菌落数均小于30 CFU，按稀释度最低的平板计数结果乘以稀释倍数报告。
   • 若所有平板菌落数均大于300 CFU且无蔓延，按稀释度最高的平板计数结果乘以稀释倍数报告，注明“估计菌落数”。
   • 若平板出现蔓延菌落无法计数，报告“菌落蔓延”。
   • 若空白对照有菌生长，试验无效。
   • 报告应包含：样品信息、检测依据（本方法）、检测方法简述（倾注/涂布）、培养温度和时间、结果（含单位）、检测日期、操作人员等。

注意事项：

1. 严格无菌操作： 全过程必须在生物安全柜或超净工作台进行，所有接触样品的器材必须无菌，防止外源性污染。
2. 中和剂有效性： 中和剂的选择及浓度至关重要，必须通过预试验确认其能有效中和抗菌剂残留且自身无毒害。
3. 样品代表性： 液体样品取样前应混匀，固体样品应取有代表性的部分。
4. 稀释均匀度： 每一步稀释均需充分振荡或混匀，确保微生物分布均匀。
5. 及时接种： 样品稀释后应尽快接种培养，减少微生物死亡或繁殖。
6. 培养温度与时间： 严格控制培养温度和规定时间。霉菌培养时间较长，需逐日观察记录早期生长情况并标记蔓延菌落。
7. 菌落识别： 真菌菌落形态多样，计数时需注意区分酵母菌（通常较小、光滑、湿润、乳白色）和霉菌（较大、干燥、多呈绒毛状、颜色各异）。必要时可进行镜检确认。注意区分气泡、杂质与菌落。
8. 生物安全： 处理阳性对照菌株（尤其是黑曲霉等产孢丰富的霉菌）时需格外谨慎，防止孢子扩散，操作应在生物安全柜中进行。
9. 质量控制： 每次试验必须同时进行阳性对照和空白对照，以确保试验系统可靠。

质量控制：

• 培养基质控： 定期使用标准菌株（如白色念珠菌、黑曲霉）进行生长试验，验证培养基促生长能力。
• 无菌性检查： 每批次培养基随机抽取适量进行无菌培养（35-37°C 或 20-25°C培养48小时以上），应无菌落生长。
• 人员比对： 定期进行人员间平行试验比对或使用标准质控样品考核。
• 设备监控： 定期校验天平、移液器、温度计、培养箱及灭菌锅等关键设备。

局限性：

• 该方法测定的是样品中能生长形成菌落的、活的真菌数量（CFU），不代表微生物的绝对总数（包含不能培养的、受损的或死亡的）。
• 结果受培养条件（培养基成分、温度、湿度、时间）影响显著。
• 混合菌群中生长快的菌可能掩盖生长慢的菌。
• 对蔓延生长严重的霉菌菌落难以准确计数。
• 无法区分具体的真菌种类。

本方法提供了一个评估抗菌剂抗真菌效果的标准操作框架，具体应用时需根据样品的特性和检测目的，严格遵循无菌操作规程和质量控制要求，确保检测结果的准确性和可靠性。