浸渍抑菌试验

发布时间：2025-07-01 18:12:46 阅读量：3 作者：生物检测中心

浸渍抑菌试验方法详解

浸渍抑菌试验是一种在实验室条件下，通过将测试样本浸渍于特定浓度的菌悬液中一定时间，随后检测菌液中活菌数量变化，从而评价材料或物质表面或自身抗菌性能的常用体外试验方法。该方法操作相对简便，结果直观，广泛应用于纺织、塑料、涂料、消毒产品及抗菌材料研发等领域的初步抗菌效果筛选和评价。

一、 试验目的
定量评价受试样品经特定时间浸渍接触后，对目标微生物的抑制或杀灭能力。核心指标是计算抑菌率或杀菌率，反映受试物的抗菌活性强弱。

二、 试验原理
将受试样品（或含有抗菌成分的溶液）与已知浓度的菌悬液充分混合接触。在设定的接触时间（如18-24小时或更短）内，样品中的抗菌成分（或材料表面的抗菌特性）作用于微生物，干扰其正常生长代谢甚至导致死亡。接触结束后，通过标准平板计数法测定混合液中或经稀释后混合液中的存活菌落数，并与空白对照组比较，计算抑菌率。

三、 试验材料与设备

  1. 试验菌种： 根据测试需求选择标准菌株，常见的有：
    • 革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌
    • 革兰氏阴性菌：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌
    • 真菌：白色念珠菌
    • （注：菌种需经活化确认，使用对数生长期菌悬液）
  2. 培养基：
    • 营养肉汤：用于菌种活化、增菌培养。
    • 营养琼脂：用于菌悬液制备和平板活菌计数。
    • （若测试真菌，则需相应的沙氏培养基等）
  3. 受试样品：
    • 固体材料： 裁剪成规定大小（如5cm x 5cm）的样片，确保表面清洁无污染。需设置同材质无抗菌处理的样品作为阴性对照。
    • 液体/粉状物质： 需用无菌稀释液（如磷酸盐缓冲液PBS）溶解或稀释至测试所需浓度。
  4. 稀释液： 无菌磷酸盐缓冲液或生理盐水。
  5. 主要设备：
    • 恒温培养箱
    • 恒温振荡水浴箱（或摇床）
    • 生物安全柜/超净工作台
    • 高压蒸汽灭菌锅
    • 旋涡混合器
    • 移液器及无菌吸头
    • 无菌锥形瓶、试管、平皿
    • 菌落计数器
  6. 其他： 无菌镊子、酒精灯、记号笔等。
 

四、 试验步骤

  1. 菌悬液制备：
    • 将活化后的试验菌接种至营养肉汤，在适宜温度下振荡培养至对数生长期（通常培养18-24小时）。
    • 取适量培养物，离心后弃上清，用无菌稀释液洗涤菌体并重悬。
    • 调整菌悬液浓度至约1×10⁸ – 5×10⁸ CFU/mL（菌落形成单位/毫升），作为工作菌悬液。需用平板计数法确认实际浓度。
  2. 样品准备：
    • 固体样品： 将样片放入无菌锥形瓶或试管中。
    • 液体/粉状样品： 在无菌容器中用无菌稀释液配制好所需浓度的受试液。
  3. 接种与接触：
    • 向装有固体样品的容器中加入一定体积（如20mL）的工作菌悬液，确保样品完全浸没。设置仅加入等量菌悬液和稀释液的阳性对照组（无样品），以及阴性对照组（样品+无菌稀释液）。
    • 对于液体/粉状受试物，取一定体积的受试液与等体积的工作菌悬液在无菌试管中混合均匀。
    • 将混合后的锥形瓶/试管置于恒温振荡水浴箱（或摇床）中，在设定温度（如37℃）下以一定转速振荡培养特定的接触时间（如24小时±1小时）。确保充分接触。
  4. 接触后处理与活菌计数：
    • 接触时间结束后，立即从振荡器中取出样品。
    • 对于固体样品： 充分振摇混合液。吸取一定体积（如1mL）的混合液或其系列10倍梯度稀释液（如10⁻¹, 10⁻²），接种至无菌平皿中，倾注约45℃的营养琼脂，迅速摇匀。
    • 对于液体受试物： 直接取混合液或其系列稀释液进行倾注培养。
    • 同时，对阳性对照组（仅含菌悬液和稀释液）进行同样操作和梯度稀释（通常稀释度高于试验组）。
    • 将接种后的平皿倒置，放入恒温培养箱中在适宜温度下培养规定时间（细菌通常24-48小时，真菌通常48-72小时）。
  5. 菌落计数：
    • 培养结束后，对平皿上的菌落进行计数。选择菌落数在30-300 CFU之间的平皿进行计数。同一稀释度至少做两个平行平皿。
    • 记录各组的平均菌落数。
 

五、 结果计算与评价

  1. 计算存活菌数：
    • 根据平皿计数结果和稀释倍数，计算阳性对照组（C）和试验组（T）在接触时间结束时的平均活菌浓度（CFU/mL或CFU/样片）。
  2. 计算抑菌率/杀菌率：
    • 抑菌率： 反映样品抑制细菌生长的能力。
      抑菌率 (%) = [(C - T) / C] × 100%
    • 杀菌率： 反映样品杀灭细菌的能力（更常用）。
      杀菌率 (%) = [(C - T) / C] × 100% （公式与抑菌率相同，但理解侧重点不同，当杀菌率很高时，如≥99.9%，常称为杀菌效果）。
    • 杀菌活性值： 也可计算杀菌活性值 R = lgC - lgT。当 R ≥ 2（即杀菌率 ≥ 99%）时，通常认为样品具有显著的杀菌效果。
  3. 结果评价：
    • 阴性对照组应无菌生长，否则试验无效。
    • 阳性对照组活菌数应在预期范围内（如≥1×10⁷ CFU/mL），证明菌悬液有效且接触期间细菌在无抗菌条件下正常存活。
    • 根据计算出的抑菌率/杀菌率或杀菌活性值 R，参照相关标准或研究目的，判断样品的抗菌效果是否达到要求（例如：杀菌率 ≥ 90% 认为有抑菌作用，≥99%认为有较强杀菌作用，≥99.9%认为有强杀菌作用）。
 

六、 注意事项

  1. 无菌操作： 整个试验过程必须在无菌条件下（如生物安全柜内）进行，防止外源污染。
  2. 菌种活性： 使用处于对数生长期、活力旺盛的菌种，保证初始菌悬液浓度准确。
  3. 接触均一性： 振荡条件（转速、振幅）需保证菌悬液与样品充分、均一接触。对于固体样品，避免样片堆叠。
  4. 及时中止反应： 接触时间到达后，应尽快进行稀释和倾注操作，防止残留抗菌成分继续作用。
  5. 稀释充分： 对于抗菌性强的样品，必须进行足够梯度的稀释，确保能获得可计数的平板。必要时可加入中和剂（如卵磷脂、吐温80、硫代硫酸钠等）到稀释液或琼脂中以中和残留抗菌剂，但需验证中和效果。
  6. 平行试验： 每个试验组和对照组均应设置足够的平行样（通常≥3），以保证结果的可靠性。
  7. 对照设置： 阴性对照（样品+无菌液）和阳性对照（无菌液+菌液）必不可少，它们是结果有效性的关键判据。
  8. 标准化： 应遵循相关的国家标准、行业标准或国际标准（如ISO, JIS, AATCC中的相关方法）进行操作，以保证结果的可比性。
 

总结：
浸渍抑菌试验作为一种基础的定量抗菌测试方法，通过模拟材料或物质在液态环境中与微生物的接触过程，能有效评估其抑制或杀灭微生物的能力。该方法的结果受菌种、接触时间、温度、振荡条件、中和效果等多种因素影响，因此严格控制试验条件和规范操作流程是获得准确、可靠结果的关键。它为抗菌产品的研发、质量控制及性能比较提供了重要的科学依据。