抑菌剂抗真菌效力定性检测方法
目的： 本方法旨在通过定性手段评估抑菌剂对特定真菌菌株的抑制效果，初步判定其是否具有抑制该真菌生长的能力。
一、原理
抑菌剂通过干扰真菌细胞壁合成、破坏细胞膜完整性、抑制蛋白质或核酸合成等途径发挥抗真菌作用。本试验采用琼脂扩散法（或称为纸片法、打孔法），将待测抑菌剂样品（或含抑菌剂的溶液）置于已均匀接种目标真菌的固体培养基表面。抑菌剂在琼脂中扩散，形成浓度梯度。若抑菌剂具有抑制该真菌生长的效力，则在其有效扩散范围内，真菌的生长将受到抑制，形成清晰的抑菌圈。抑菌圈的有无及大小（虽定性检测更侧重有无，但可观察相对大小作为参考）可直观反映抑菌剂对该菌株的抑制效果。
二、材料与试剂
- 菌种： 标准真菌菌株（如：白色念珠菌 ATCC 10231，黑曲霉 ATCC 16404 或其他相关受试菌株）。菌株应经活化验证，处于对数生长期。
- 培养基：
- 沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA)： 用于真菌的培养和试验。配制后高压灭菌（121°C, 15分钟），倾注平板备用。
- 沙氏葡萄糖肉汤培养基 (SDB) 或无菌生理盐水： 用于制备菌悬液。
- 待测样品： 抑菌剂原液或按特定浓度配制的抑菌剂溶液（需明确浓度）。
- 对照：
- 阳性对照： 已知对目标真菌具有良好抑制作用的标准化合物（如两性霉素B、酮康唑等）溶液。
- 阴性对照： 溶解抑菌剂的溶剂（如无菌水、乙醇、DMSO等，需与样品所用溶剂一致，且确认溶剂本身无抑菌作用）。
- 实验器材：
- 无菌培养皿
- 无菌棉签或无菌涂布棒
- 无菌移液器及吸头
- 无菌镊子
- 无菌打孔器（直径约6mm）或无菌空白药敏纸片
- 恒温培养箱（根据菌种设定温度，通常25-28°C或30-35°C）
- 生物安全柜
- 游标卡尺或测量尺（用于观察抑菌圈大小）
- 消毒剂： 如70%乙醇，用于实验台面及器材消毒。
- 生物安全： 实验室需具备相应的生物安全级别（通常BSL-2），操作人员需穿戴个人防护装备（实验服、手套、口罩等）。
三、实验步骤
- 培养基准备： 将融化并冷却至约45-50°C的SDA培养基均匀倾注入无菌培养皿中（厚度约4mm），待其凝固。
- 菌悬液制备：
- 从新鲜培养的SDA平板上挑取目标真菌菌落。
- 若为酵母样真菌（如念珠菌），将其接种于SDB中，于适宜温度下振荡培养18-24小时（或至对数生长期）。用无菌生理盐水或SDB调整菌悬液浓度至约0.5麦氏比浊标准（约含菌量1×10⁸ ~ 5×10⁸ CFU/mL）。
- 若为丝状真菌（如曲霉），用含有0.05%吐温80的无菌生理盐水洗下孢子，经脱脂棉或玻璃棉过滤去除菌丝，调整孢子悬液浓度至约1×10⁶ CFU/mL。
- 接种平板：
- 用无菌棉签或涂布棒蘸取调整好的菌悬液，在SDA平板表面均匀涂布三次，每次旋转平板约60°，确保菌液均匀分布。最后用棉签沿平板边缘涂抹一圈。
- 静置5-10分钟，使琼脂表面吸收多余水分。
- 加样：
- 纸片法： 用无菌镊子夹取无菌空白药敏纸片，轻轻蘸取待测抑菌剂样品溶液（或直接滴加适量溶液于纸片上，使其饱和但无滴落），将纸片轻轻贴于已接种真菌的琼脂表面。每个平板可贴3-4个样品纸片（包括阳性和阴性对照），纸片间距应大于25mm，距离平板边缘大于15mm。
- 打孔法： 用无菌打孔器在已接种真菌的琼脂上打孔（避免打穿），用无菌针头或镊子小心移除孔内琼脂块。用移液器向孔内加入一定量（如50-100μL）的待测抑菌剂样品溶液。同样设置阳性和阴性对照孔。
- 培养： 将平板正置，置于设定好温度的恒温培养箱中培养。根据真菌生长速度确定培养时间，通常酵母菌培养24-48小时，丝状真菌培养48-72小时，或直至阴性对照生长良好。
- 观察与记录：
- 培养结束后，取出平板。
- 观察纸片（或孔）周围是否有清晰、透明的抑菌圈形成。
- 用游标卡尺测量抑菌圈的直径（包括纸片或孔的直径），精确到0.5mm。对于丝状真菌，抑菌圈边缘可能不如酵母菌清晰，需仔细观察生长受抑边界。
- 详细记录每个样品（包括对照）的抑菌圈直径、清晰度以及平板整体的真菌生长状况。拍照留存。
四、结果判定
- 阳性对照： 应出现清晰、大小符合预期的抑菌圈，证明试验系统有效。
- 阴性对照： 纸片或孔周围应无抑菌圈形成，真菌应生长至纸片或孔边缘，证明溶剂本身无抑菌作用。
- 待测样品：
- 具有抑制真菌作用： 在纸片或孔周围形成清晰可辨的抑菌圈（即使很小）。抑菌圈直径越大，通常表明抑菌效力相对越强（此为定性基础上的初步半定量观察）。
- 无抑制真菌作用： 纸片或孔周围无抑菌圈形成，真菌生长直至纸片或孔边缘，与阴性对照相似。
- 结果存疑： 抑菌圈模糊不清，或真菌在抑菌圈内出现微弱生长（卫星菌落）。需考虑重复试验，或结合定量方法进一步确认。
五、注意事项
- 无菌操作： 所有步骤必须严格遵守无菌操作规程，防止杂菌污染。
- 菌种状态： 使用活力强、处于对数生长期的菌悬液是试验成功的关键。菌悬液浓度需标准化。
- 培养基厚度与均匀性： 琼脂厚度需均一，过厚影响抑菌剂扩散，过薄易破裂。
- 接种均匀性： 菌液涂布必须均匀，否则可能导致抑菌圈不规则。
- 抑菌剂浓度与加样量： 待测样品的浓度和加样量（纸片吸液量或孔内加入量）应保持一致，否则结果无可比性。需明确记录样品浓度。
- 扩散条件： 加样后应尽快将平板正置放入培养箱，避免抑菌剂在琼脂中扩散前流淌。平板在培养前应水平放置。
- 培养条件： 温度、湿度（通常培养箱可满足）、培养时间需严格控制。
- 结果解读： 琼脂扩散法主要用于定性或半定量筛选，抑菌圈大小受抑菌剂溶解度、扩散速度、分子量等多种因素影响，不能精确等同于最小抑菌浓度(MIC)。抑菌圈大小仅能在相同实验条件下进行相对比较。
- 生物安全： 操作真菌，特别是丝状真菌孢子时，务必在生物安全柜中进行，妥善处理废弃物，防止实验室感染和环境污染。
- 重复性： 为获得可靠结果，建议每个样品和对照至少做双份平行试验。如果结果差异较大，应进行重复实验。
结论：
本琼脂扩散法提供了一种相对简便、直观的定性评估抑菌剂抗真菌效力的手段。通过观察抑菌圈的有无，可以初步判断待测抑菌剂是否对特定目标真菌具有生长抑制作用。该方法适用于抑菌剂的初步筛选和效力比较。如需更精确的定量结果（如MIC值），应结合试管稀释法或微量肉汤稀释法等定量检测方法进行确认。