抑菌剂中大肠杆菌群检测

发布时间:2025-07-01 17:46:45 阅读量:1 作者:生物检测中心

抑菌剂中大肠杆菌群检测:方法、意义与质量控制

一、引言

抑菌剂作为一类能抑制或延缓微生物生长的化学制剂,广泛应用于个人护理用品、家居清洁产品、医疗消毒及工业水处理等领域。其核心功能要求产品自身在生产、储存和使用过程中保持良好的卫生状态,避免成为微生物污染源,尤其是不能含有特定致病菌或指示菌。大肠杆菌群(Coliforms) 作为重要的卫生指示菌,其存在通常预示产品可能受到粪便污染,并可能存在肠道致病菌(如致病性大肠杆菌、沙门氏菌等)的风险。因此,对抑菌剂产品进行大肠杆菌群检测,是评价其卫生安全性的关键环节,也是相关法规和标准(如各国的消毒产品卫生规范、化妆品安全技术规范等)的强制性要求。

二、大肠杆菌群的定义与卫生学意义

大肠杆菌群并非一个严格的分类学概念,而是一组卫生指示菌。其定义为:

  • 需氧及兼性厌氧。
  • 在一定培养条件下(通常为36±1℃培养48±2小时)。
  • 能发酵乳糖产酸产气。
  • 革兰氏阴性无芽孢杆菌。
 

该菌群主要包括大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)等。在抑菌剂检测中,检出大肠杆菌群可能揭示:

  1. 原料污染: 生产用水或原材料受到人或动物粪便污染。
  2. 生产过程污染: 生产设备、环境或人员操作卫生控制不到位。
  3. 包装密封不良: 产品包装在储存或运输过程中受损,导致微生物侵入。
  4. 抑菌效力不足: 产品本身的防腐体系或配方有效性存在缺陷,无法抵御微生物污染。
    因此,大肠杆菌群的检测结果是评判抑菌剂产品卫生质量、生产控制水平及潜在健康风险的重要依据。
 

三、检测标准与方法

目前,国内外普遍采用基于最大可能数法(Most Probable Number, MPN) 的培养检测方法作为抑菌剂中大肠杆菌群检测的标准方法(参照GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》等类似适用于非食品基质的卫生标准原理)。该方法分为三个步骤:

  1. 样品制备与稀释:

    • 中和处理(关键步骤): 这是抑菌剂检测区别于普通样品的核心环节。由于产品本身含有抑菌/杀菌成分,会抑制目标微生物(大肠杆菌群)的生长,导致假阴性结果。必须在取样后立即加入合适种类和浓度的中和剂,有效中和产品的抑菌活性。常用的中和剂根据产品类型选择(如硫代硫酸钠中和含氯消毒剂,卵磷脂-吐温80中和季铵盐类、酚类消毒剂等)。中和剂的选择和有效性需经过验证。
    • 无菌操作: 整个取样、转移、稀释过程必须在无菌条件下进行,防止外来污染。
    • 梯度稀释: 将中和后的样品用适宜的稀释液(如磷酸盐缓冲液PBS或生理盐水)进行系列十倍稀释,以获得适宜的检测浓度范围。
  2. 初发酵试验(推定试验):

    • 选取适宜的3个连续稀释度的样品液,接种至装有月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose, LST)肉汤的发酵管中(通常采用9管法,即每个稀释度做3管)。
    • 培养: 将接种好的发酵管置于36±1℃恒温培养箱中培养48±2小时。
    • 观察: 观察每管是否产气(发酵管内倒置小导管内有气泡)。在该培养条件下,所有能发酵乳糖产气的细菌(包括大肠杆菌群和其他产气菌)均可能表现为阳性(产气)。
  3. 复发酵试验(证实试验):

    • 接种: 将所有在LST肉汤中产气的发酵管转种到煌绿乳糖胆盐肉汤(Brilliant Green Lactose Bile, BGLB) 发酵管中。
    • 培养: 再次将BGLB管置于36±1℃恒温培养箱中培养48±2小时。
    • 观察: 观察每管是否产气。BGLB肉汤中的胆盐和煌绿能抑制大多数非肠道革兰氏阳性菌的生长,提高了对大肠杆菌群的特异性。在BGLB管中产气的菌株,可确证为大肠杆菌群阳性。
 

四、结果计算与报告

  1. 查阅MPN表: 根据初发酵试验(LST)中呈阳性(产气)的管数组合(例如:某个稀释度3管中有2管产气,下一个稀释度3管中有1管产气,再下一个稀释度3管无产气,组合即为2-1-0),查阅标准MPN检索表。
  2. 计算MPN值: MPN检索表提供了每克(或每毫升)样品中大肠杆菌群的最大可能估计数(MPN/g或MPN/mL)。
  3. 报告结果: 报告为“大肠杆菌群:<MPN值> MPN/g (或 mL)”。例如,“大肠杆菌群:<3.0 MPN/g”。结果低于方法最低检出限时,报告为“未检出”或“<最低检出限值”(如“<3.0 MPN/g”)。
 

五、质量控制要点

检测结果的准确性和可靠性至关重要,需严格实施质量控制:

  1. 实验室环境与无菌操作: 检测应在洁净度符合要求的微生物实验室进行,操作人员严格遵守无菌操作规程(无菌衣、口罩、手套、酒精灯、超净工作台/生物安全柜)。
  2. 培养基质量控制: 使用前需确认培养基的灭菌效果(无菌试验)和适用性(阳性菌生长试验、阴性菌抑制试验)。定期检查培养基的储存条件和有效期。
  3. 中和剂验证: 必须通过验证试验证明所选用的中和剂及中和程序能有效中和待测抑菌剂样品的抑菌活性,且中和剂本身及中和产物对目标微生物无毒性(无抑制/促进生长作用)。这是抑菌剂检测成功的关键前提。
  4. 阳性与阴性对照:
    • 阳性对照: 使用标准大肠杆菌菌株(如ATCC 25922)接种到不含抑菌剂的稀释液中,按相同步骤操作,应能正常生长并得到阳性结果。
    • 阴性对照: 无菌稀释液或中和剂溶液接种培养基,培养后应无菌生长(阴性结果)。同时设立样品空白对照:将中和剂加入稀释液(不含样品),然后按样品检测步骤操作,应无菌生长(确证中和剂和操作过程无污染)。
  5. 培养基空白: 每批次试验应包含未接种的培养基对照(LST和BGLB),培养后应保持澄清无菌生长。
  6. 设备监控: 定期校准培养箱(温度)、天平、移液器等设备。
  7. 人员培训与能力确认: 操作人员需经过严格培训并通过能力验证。
 

六、结果解读与应用

  1. 符合性判定: 将检测结果与相关产品标准、法规或技术规范中的限量要求进行比对。对于抑菌剂产品,通常要求“不得检出”大肠杆菌群(即结果应低于方法检出限,如 <3.0 MPN/g 或 <1 MPN/g)。
  2. 质量反馈: 若检出大肠杆菌群:
    • 表明产品存在卫生安全隐患,应立即启动不合格品控制程序。
    • 需追溯污染来源(原料、生产过程、包装、储存运输等环节),进行根本原因分析。
    • 评估产品的防腐体系或配方有效性,必要时进行改进。
    • 对同批次或受影响批次产品进行隔离、评估和处置(如召回、销毁)。
  3. 生产过程监控: 定期对原料、中间品、成品及生产环境(如关键控制点)进行大肠杆菌群监控,是预防污染、保证产品质量稳定的重要手段。
 

七、总结

抑菌剂中大肠杆菌群检测是保障产品卫生安全、符合法规要求、维护消费者健康的关键控制措施。检测过程必须严格遵循标准方法,尤其要重视中和剂的有效使用与验证这一核心技术环节。规范的实验室操作、完善的质量控制体系以及准确的结果解读,共同构成了确保检测结果有效可靠的基础。持续的微生物监控和质量改进对于抑菌剂产品的安全性和市场信誉至关重要。

参考文献(示例格式):

  • GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数。 (虽为食品标准,其原理与方法常被借鉴用于其他基质如抑菌剂,实际操作应参照适用的具体产品卫生规范或标准)。
  • 《化妆品安全技术规范》(最新版)。 (规范中对化妆品微生物指标有明确规定,包含菌落总数、霉菌和酵母菌总数、耐热大肠菌群/大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等项目要求及检验方法。抑菌型化妆品参照此规范)。
  • 《消毒技术规范》(最新版)。 (针对各类消毒产品,包含详细的微生物学检验方法、评价要求及中和剂选择指南)。
  • 相关国际标准(如ISO、ASTM、USP中关于非无菌产品微生物检查、消毒剂检测的部分)。
  • 《中华人民共和国药典》(最新版)通则 1105、1106、1107非无菌产品微生物限度检查法、控制菌检查法、微生物计数法。 (适用于药品及药用辅料等,其原则和方法部分可参考)。
 

注意:

  • 实际操作中,必须遵循产品所适用的、现行有效的国家或行业强制性标准/规范的具体要求。
  • 中和剂的选择和使用浓度对抑菌剂检测的成功至关重要,务必通过验证试验确认有效性。
  • 无菌操作是所有微生物检测的生命线。