抑菌剂中真菌菌落总数检测

抑菌剂中真菌菌落总数检测指南

目的：
准确测定抑菌剂产品中残存的具有代谢活性的真菌（包含酵母菌和霉菌）数量，评估产品微生物污染水平及防腐效能，保障产品质量与使用安全。

检测原理：
通过特定中和剂消除样品中抑菌成分的持续作用，将处理后的样品或系列稀释液与熔化的选择性培养基混合（倾注法），或均匀涂布于选择性培养基表面（涂布法）。在适宜温度下培养规定时间后，对形成的典型真菌菌落进行计数，以单位质量或体积样品中的菌落形成单位数（CFU/g 或 CFU/mL）表示真菌菌落总数。

材料与试剂：

1. 培养基：
   • 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：基础培养基。
   • 含抗菌剂培养基：在 SDA/PDA 基础上，按标准加入适量氯霉素（0.05-0.1 g/L）或庆大霉素（40-50 mg/L）及氯四环素（0.1 g/L），抑制细菌生长。
2. 稀释液：
   • 0.1% 蛋白胨生理盐水：基础稀释液。
   • 含中和剂的稀释液（关键）：
     • 常用中和剂组合： 3% 吐温 80 + 0.3% 卵磷脂 + 0.1% 硫代硫酸钠 + 0.3% 组氨酸（或 0.1% 组氨酸盐酸盐） + 0.5% 皂土。
     • 根据产品成分调整： 针对季铵盐类，需增加吐温80和卵磷脂比例；针对含汞、银制品，需含足量硫代硫酸钠；针对醛类，需含亚硫酸氢钠；针对酚类、醇类，稀释即可；针对染料（如吖啶黄），需含卵磷脂。
     • 验证： 所用中和体系必须通过“中和剂效能验证试验”及“残留抑菌活性试验”确认有效。
3. 其他：
   • 无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）。
   • 无菌吸管（1mL, 10mL）、无菌培养皿（直径90mm）、无菌锥形瓶、无菌均质袋/均质杯及均质器、无菌玻璃珠、恒温水浴锅（45±1℃）、恒温培养箱（20-25℃）、菌落计数器或电子计数设备、酒精灯、记号笔等。

检测步骤：

1. 样品前处理：

   • 液体样品： 振摇混匀。若粘稠，可预热至40℃助溶。无菌操作吸取代表性样品10mL（或10g）加入到含90mL已灭菌并预冷的含中和剂稀释液的锥形瓶（或均质袋）中，充分振摇（或均质器拍打1-2分钟）混匀，制成1:10的初始稀释液（10⁻¹）。
   • 固体/半固体样品： 无菌称取代表性样品10g，加入含90mL含中和剂稀释液及适量无菌玻璃珠的锥形瓶或均质袋中，充分振荡（或均质器拍打1-2分钟）混匀，制成1:10初始稀释液（10⁻¹）。
   • 注意： 操作应迅速，避免样品暴露时间过长。

2. 系列稀释：

   • 用无菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁缓慢注入盛有9mL含中和剂稀释液的无菌试管中（或用无菌吸管直接在均质袋内转移，注意更换吸头或吹打混匀），振摇试管或拍打均质袋使其混合均匀，制成1:100（10⁻²）稀释液。
   • 按同样方法，依次制备10⁻³、10⁻⁴等更高稀释度的稀释液。每次稀释应更换无菌吸管（或吸头）。

3. 接种与培养：

   • 倾注法：
     1. 选择2-3个适宜稀释度（通常为10⁰、10⁻¹、10⁻²，或根据预估污染情况选择更高稀释度），用无菌吸管分别吸取1mL稀释液放入两个无菌平皿中。
     2. 将熔化并冷却至45±1℃的含抗菌剂培养基（如SDA+氯霉素/庆大霉素）倒入平皿（约15-20mL/皿），立即轻轻转动平皿，使样品稀释液与培养基充分混合均匀。凝固后倒置平皿。
   • 涂布法：
     1. 选择2-3个适宜稀释度，用无菌吸管分别吸取0.1mL稀释液，加入到已凝固的含抗菌剂琼脂平板上。
     2. 用无菌L形涂布棒，将样液均匀涂布于整个平板表面（注意避免触及边缘）。待样液被完全吸收后，倒置平皿。
   • 阴性对照： 同时进行2个空白对照实验：分别吸取1mL含中和剂稀释液（倾注法）或0.1mL（涂布法）加入到无菌平皿中，操作同上。用于检测稀释液、培养基及无菌操作过程是否污染。
   • 培养： 将接种后的平板倒置于恒温培养箱中，在20-25℃下培养5-7天（霉菌生长较慢，需保证充足时间）。某些标准或特殊样品可能需要培养更长时间（如7天或14天）。

4. 菌落计数与报告：

   • 计数时机： 建议在培养第3天、第5天、第7天分别观察计数（特别是霉菌）。最终计数以菌落数稳定、不再显著增加的培养时间为准（通常为5或7天）。
   • 计数方法： 肉眼观察计数平板上的菌落数。必要时用放大镜（≤5倍）或菌落计数器辅助计数。区分细菌菌落（通常较小、湿润、光滑、边缘规则）与真菌菌落（通常较大、干燥、绒毛状、絮状、粉末状、边缘不规则，酵母菌落则与细菌相似但通常更大更凸起）。只计数典型真菌菌落。
   • 稀释度选择： 选择平均菌落数在10-150 CFU之间的稀释度（涂布法选择30-300 CFU）进行计算。若相邻两个稀释度均在此范围，先计算其比值：
     • 比值 ≤ 2：报告两稀释度平均值。
     • 比值 > 2：报告较低稀释度的菌落数。
   • 计算：
     • 倾注法： 真菌菌落总数 (CFU/g 或 CFU/mL) = ∑C / [(n₁ + 0.1n₂) × d]
       • ∑C：所有适宜稀释度平板（菌落在10-150之间）的菌落数之和。
       • n₁：第一稀释度（较低稀释度）的平板数。
       • n₂：第二稀释度（较高稀释度）的平板数。
       • d：第一稀释度的稀释倍数（如10⁻¹，则d=10）。
     • 涂布法： 真菌菌落总数 (CFU/g 或 CFU/mL) = ∑C / [(n₁ + 0.1n₂) × d × V]
       • V：涂布于每个平板上的样液体积（mL），通常为0.1mL。
     • 示例： 10⁻¹稀释度（2个平板）菌落数：120, 140；10⁻²稀释度（2个平板）菌落数：15, 17。
       • 比值 = (120+140)/2 / (15+17)/2 = 130 / 16 = 8.125 > 2
       • 故采用较低稀释度（10⁻¹）的菌落数：(120+140)/2 = 130
       • 结果 = 130 / [(2 + 0.1×2) × 10⁻¹] = 130 / (2.2 × 0.1) = 130 / 0.22 ≈ 591 CFU/g(mL) （倾注法）。
   • 结果报告：
     • 可计数范围： 结果报告为XX CFU/g 或 XX CFU/mL。
     • 均<10： 若所有平板菌落数均小于10，报告为“小于10乘以最低稀释倍数的倒数”。如最低稀释度10⁻¹平均菌落数为5，则报告为＜50 CFU/g(mL)。
     • 均>150（倾注）/300（涂布）： 报告为“大于最高稀释度的平均菌落数乘以最高稀释倍数”。如最高稀释度10⁻²平均菌落数为200（涂布法），则报告为＞200 × 10² = ＞20, 000 CFU/g(mL) / 0.1mL = ＞200, 000 CFU/g(mL) （需乘以1/V，涂布0.1mL时乘以10）。
     • 阴性对照有菌： 本次试验无效，需重做。
     • 所有平板菌落蔓延： 报告“菌落蔓延”。
     • 最终报告： 应包括检测方法（倾注法/涂布法）、培养基名称、培养温度和时间、最终结果（平均值）。

质量控制：

1. 方法适用性验证（关键）： 正式检测样品前，必须验证所选中和剂及检测方法能有效中和样品抑菌性且对微生物无明显毒性。
   • 中和剂效能验证： 向样品中加入已知量目标真菌（如白色念珠菌、黑曲霉孢子悬液），作用一定时间（如≤5分钟）后立即检测。回收菌落数应≥对照回收菌落数（相同菌量直接加入含中和剂的稀释液中检测）的70%。
   • 残留抑菌活性试验： 取经中和处理的样品混合液（或最高测试浓度稀释液），加入已知量目标真菌，作用一定时间（如≤5分钟）后涂布或倾注培养。其菌落数与仅用中和剂稀释液的对照组应无显著差异（通常菌落数下降不超过50%）。
2. 培养基质量控制： 新批次培养基应进行无菌性检查和生长性能检查（接种目标真菌，生长应良好）。
3. 实验环境监控： 定期进行沉降菌或接触碟监测，确保无菌操作环境符合要求。
4. 人员操作： 定期进行人员比对或使用标准样品进行考核。

结果解释与注意事项：

1. 数值意义： 真菌菌落总数反映产品在生产、储存或使用过程中受到真菌污染的程度。数值越高，污染风险越大。
2. 标准对照： 结果需参照适用的产品卫生标准、法规要求或企业内控标准进行判定。
3. 特殊形态： 若菌落形态复杂难以辨别，可延长培养时间观察典型特征或进行镜检确认。
4. 抑菌活性残留： 中和不彻底是检测失败主因，务必保证中和剂选择和浓度恰当并通过验证。高浓度残留可能导致假阴性结果（菌落数偏低甚至无菌生长）。
5. 培养条件： 严格控制在20-25℃（霉菌最适温度）。温度过高易导致细菌过度生长干扰计数或抑制部分霉菌。
6. 稀释精度： 移液和稀释操作需精确，否则影响结果准确性。
7. 生物安全： 霉菌培养物可能产生孢子气溶胶，开盖观察计数应在生物安全柜内进行，废弃培养物需经121℃高压灭菌至少30分钟后再处理。
8. 样品代表性： 取样应确保能代表整批产品。
9. 及时检测： 样品稀释后应尽快接种，避免微生物死亡或繁殖。

附录：模拟数据记录表 (表1)

| 样品信息 | 编号： | 名称：XXX抑菌剂（膏霜） | 批号： | 检测日期： |
| ：----------------- | :--------------------------------------- | :-------------------------- | :----- | :--------- |
| 检测项目 | 真菌菌落总数 | 检测方法：含中和剂倾注法 | 培养基：SDA + 氯霉素 | 培养条件：22.5℃, 7天 |
| 稀释度 | 平皿号 | 菌落计数 (CFU) | 平均菌落数 | 备注 (形态等) |
| 10⁻¹ (原样品) | 1 | 28 | 30 | 酵母样菌落 |
| | 2 | 32 | | |
| 10⁻² | 1 | 4 | 3.5 | 酵母样菌落 |
| | 2 | 3 | | |
| 10⁻³ | 1 | 0 | 0 | |
| | 2 | 0 | | |
| 阴性对照 | 1 | 0 | 0 | |
| (含中和剂稀释液) | 2 | 0 | | |

计算过程：

• 适宜稀释度：10⁻¹ (平均30 CFU, 在10-150范围内)；10⁻² (平均3.5 CFU, <10，不采用)。
• 比值 = (仅有一个适宜稀释度，无需计算比值)。
• 结果 = 30 / [(2 + 0.1×0) × 10⁻¹] = 30 / (2 × 0.1) = 30 / 0.2 = 150 CFU/g (注：本例为固体膏霜样品)

报告结果： 真菌菌落总数：150 CFU/g (倾注法，沙氏葡萄糖琼脂+氯霉素，22.5℃，7天)。

通过严格执行本方法，可准确评估抑菌剂产品中的真菌污染水平，为产品质量控制和安全性评价提供可靠依据。