一次性卫生用品致病性化脓菌-溶血性链球菌检测

一次性卫生用品中致病性化脓菌——溶血性链球菌检测技术详解

引言
溶血性链球菌（Streptococcus spp.，特别是A群β-溶血性链球菌，如Streptococcus pyogenes）是一类具有高度致病性的革兰氏阳性球菌。它们广泛存在于环境中，可通过呼吸道飞沫、直接接触或间接接触污染物品传播。该菌是人体化脓性感染的主要病原体之一，可引发多种疾病，包括：

• 皮肤软组织感染： 脓疱疮、蜂窝织炎、丹毒、坏死性筋膜炎等。
• 呼吸道感染： 咽炎、扁桃体炎、猩红热。
• 严重侵袭性疾病： 链球菌中毒性休克综合征（STSS）、败血症、产褥热等。
• 自身免疫性疾病： 风湿热、急性肾小球肾炎（作为迟发并发症）。

一次性卫生用品（如卫生巾、护垫、纸尿裤、湿巾、棉签等）在生产、运输、储存和使用过程中，存在被溶血性链球菌污染的风险，尤其当产品存在破损或使用环境不洁时。受污染的产品若直接接触人体皮肤、粘膜或伤口，可能导致严重的局部或全身性感染。因此，对一次性卫生用品进行溶血性链球菌的检测，是保障消费者健康和产品安全性的重要质量控制环节。

检测依据与标准
该检测主要依据国家强制性标准《一次性使用卫生用品卫生标准》（GB 15979-2002）中附录B/B4的规定：“溶血性链球菌不得检出”。检测方法遵循该标准附录C的相关要求。

检测原理
检测的核心原理是利用目标菌的生化特性（产生链激酶、特定溶血反应）和对抗生素的敏感性进行分离与鉴定。主要流程包括：样品处理、选择性增菌培养、平板分离纯化、生化鉴定及血清学分群确认。

检测流程（基于GB 15979标准）

1. 样品采集与预处理：

   • 在无菌条件下，随机抽取待检样品（至少10g或10cm²）。
   • 将样品放入盛有适量无菌生理盐水（或0.1%蛋白胨水）的容器中。
   • 充分振摇或置于均质器中均质（如8000-10000r/min处理1-2min），制成1:10的样品匀液。

2. 增菌培养：

   • 吸取5ml样品匀液，接种于5ml葡萄糖肉浸液肉汤（或含1%葡萄糖的脑心浸液肉汤）。
   • 置培养箱中，于36±1℃培养18-24小时。
   • 目的： 促进目标菌增殖，同时抑制部分伴随微生物生长。

3. 分离培养与初步鉴定：

   • 用接种环蘸取增菌培养物，划线接种于哥伦比亚血琼脂平板（或绵羊/兔血琼脂平板）。
   • 置培养箱中，于36±1℃、含5-10% CO₂环境（可用蜡烛缸或CO₂培养箱）培养18-24小时。
   • 观察： 溶血性链球菌通常在血平板上形成细小、圆形、灰白色、半透明或不透明的菌落，周围呈现完全透明（β-型）的溶血环（这是其最重要的初步鉴定特征）。
   • 挑取可疑菌落： 挑选具有典型β-溶血环的单个菌落进行纯培养（再接种一个血平板）和后续鉴定。

4. 鉴定试验（关键步骤）：

   • 链激酶试验（SK试验）：
     • 原理： 致病性溶血性链球菌能产生链激酶（溶纤维蛋白酶），溶解人血浆中的纤维蛋白凝块。
     • 方法： 吸取0.2ml草酸钾人血浆（0.01%浓度），加入无菌试管中。加入0.5ml无菌生理盐水（或肉汤），再加入经18-24小时培养的待检菌肉汤培养物0.5ml。混匀后，置36±1℃水浴中10分钟。加入0.25ml 0.25%氯化钙溶液，混匀后再次置36±1℃水浴中。
     • 观察结果： 在10分钟内，血浆先凝固，后又逐渐溶解至完全液化状态者为阳性（通常A群链球菌在15分钟内液化）。凝固而不溶解或24小时仍不溶解者为阴性。
   • 杆菌肽敏感试验：
     • 原理： 绝大多数A群溶血性链球菌对低浓度的杆菌肽非常敏感。
     • 方法： 挑取纯化的待检菌菌落，密集划线接种于血琼脂平板上。用无菌镊子将含0.04 IU杆菌肽的纸片贴在平板中央。
     • 培养与观察： 置36±1℃、含5-10% CO₂环境培养18-24小时。
     • 结果判读： 纸片周围出现**明显的抑菌圈（直径通常 >10mm）**者为阳性（敏感的，高度提示A群）。无抑菌圈或抑菌圈很小者为阴性（不敏感的，可能为其他群）。

5. 血清学分群（可选/确证）：

   • 对于链激酶试验和杆菌肽敏感试验均阳性的菌株，如需最终确认是否为A群链球菌（S. pyogenes），可进行兰斯菲尔德（Lancefield）血清学分群。
   • 使用商品化的A群链球菌特异性抗血清进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验。若发生凝集反应则为A群链球菌阳性。

结果报告

• 阳性： 若在血平板上分离到具有β-溶血环的菌落，且链激酶试验阳性且杆菌肽敏感试验阳性（或血清学A群阳性），即可报告该样品“检出溶血性链球菌”。
• 阴性： 若增菌液接种血平板后，未分离到具有β-溶血环的菌落；或分离到的可疑菌落未能通过链激酶试验和杆菌肽敏感试验（或血清学分群非A群），则报告该样品“未检出溶血性链球菌”。

质量控制

• 阴性对照： 每次试验应设置不含样品的无菌稀释液作为阴性对照，所有步骤同步进行，确保无菌操作及试剂无污染。
• 阳性对照： 使用已知的A群溶血性链球菌标准菌株（如ATCC 19615）作为阳性对照，同步进行增菌、分离和鉴定试验，确保检测体系有效。
• 培养基质控： 使用前检查培养基是否无菌、有无干裂、污染等情况。必要时进行无菌试验和生长试验验证。

注意事项

• 无菌操作： 整个检测过程必须严格执行无菌操作技术，防止环境微生物污染样品或培养基。
• 样品代表性： 选取的样品应具有代表性，确保检测结果反映整批产品的卫生状况。
• 时效性： 样品采集后应尽快检测，如需存放，应置于4℃冷藏但不超过24小时。
• 溶血现象识别： 准确识别β-溶血环（完全透明）与其他溶血类型（如α-溶血-草绿色不完全溶血、γ-溶血-不溶血）至关重要。
• 鉴定完整性： 仅凭溶血环不能确诊为致病性溶血性链球菌（尤其A群），必须结合链激酶试验和杆菌肽敏感试验（或血清学）进行综合判定。

安全风险与防范

• 生物安全防护： 溶血性链球菌属于病原微生物，操作应在符合生物安全二级（BSL-2）要求的实验室进行。实验人员需穿戴个人防护装备（实验服、手套、口罩、必要时戴护目镜）。
• 废弃物处理： 所有接触过活菌的废弃物（培养物、培养基、枪头、离心管等）必须经过有效的消毒灭菌处理（如121℃高压灭菌≥30分钟）后再按医疗废弃物或相关规定处理，严禁随意丢弃。
• 意外处理： 如发生菌液喷溅、溢出或割伤、刺伤等意外，应立即按生物安全事故应急预案处理（如消毒、冲洗、就医等）。

结语
对一次性卫生用品进行溶血性链球菌检测，是保障产品微生物安全、预防相关感染性疾病的关键环节。严格遵循国家标准GB 15979规定的检测方法，注重无菌操作、准确识别典型特征、完成完整的生化鉴定流程，并做好必要的质量控制与生物安全防护，是获得可靠检测结果的基础。持续加强生产环节的卫生控制和质量监管，从源头降低污染风险，对于保护消费者健康、提升产品质量和市场信誉具有重要意义。消费者选择符合国家标准、检验合格的卫生用品，并注意个人卫生和使用规范，可有效规避此类致病菌带来的健康风险。