一次性卫生用品致病性化脓菌 - 金黄色葡萄球菌检测指南
一次性卫生用品（如卫生巾、护垫、纸尿裤、湿巾、纸巾等）直接或间接接触人体皮肤粘膜，其卫生质量关乎消费者健康安全。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为一种常见的致病性化脓菌，是此类产品微生物安全监控的关键对象。该菌可产生多种毒素和酶，引发皮肤软组织感染（如疖、痈、脓肿）、伤口化脓，甚至导致严重的全身性感染（如败血症、中毒性休克综合征），对免疫力低下人群尤其危险。因此，对其在一次性卫生用品中的存在进行严格检测至关重要。
本检测方法遵循现行强制性国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》（GB 15979-2002）要求，确保检测结果的科学性和可靠性。
一、 检测原理
检测基于微生物选择性培养与生化鉴定原理：
- 样品处理与稀释： 将代表性样品在无菌条件下剪碎或均质化，加入无菌稀释液（如生理盐水或磷酸盐缓冲液），充分振摇，制成初始样液。
- 选择性增菌： 将样液接种至含7.5%氯化钠的肉汤培养基中进行增菌培养。高盐环境抑制大多数非耐盐细菌生长，而金黄色葡萄球菌能耐受并增殖。
- 选择性分离： 取增菌液划线接种于选择性平板培养基（最常用卵黄氯化钠琼脂平板）。
- 卵黄氯化钠琼脂（BP平板）： 高盐抑制非耐盐菌；卵黄中的卵磷脂是金黄色葡萄球菌产生的卵磷脂酶的作用底物，在其菌落周围形成白色不透明沉淀环（卵磷脂酶阳性反应），是该菌的重要鉴定特征；甘露醇作为碳源，多数致病性金黄色葡萄球菌能发酵甘露醇产酸，使培养基中的酚红指示剂变黄，菌落周围呈现黄色晕环。
- 菌落特征观察： 典型金黄色葡萄球菌在BP平板上表现为圆形、光滑凸起、湿润、直径2-3mm的金黄色（有时白色或奶油色）菌落，菌落周围有白色沉淀环（卵磷脂酶阳性）和/或黄色晕环（甘露醇发酵阳性）。
- 确认试验：
- 血浆凝固酶试验： 挑取疑似菌落，乳化于兔（或人）血浆中，37℃培养。致病性金黄色葡萄球菌通常产生血浆凝固酶，使血浆凝固成胶冻状（阳性）。这是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的“金标准”。
- 革兰氏染色镜检： 典型形态应为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
- 过氧化氢酶试验： 应为阳性（产生气泡）。
二、 检测所需材料与设备
- 培养基与试剂：
- 7.5%氯化钠肉汤培养基
- 卵黄氯化钠琼脂（BP琼脂）平板
- 无菌稀释液（生理盐水或0.1%蛋白胨磷酸盐缓冲液）
- 兔（或人）血浆（含EDTA或柠檬酸钠抗凝剂）
- 革兰氏染色液
- 3%过氧化氢(H₂O₂)溶液
- 无菌剪刀、镊子、均质袋/均质杯
- 设备：
- 恒温培养箱（36±1℃）
- 生物安全柜（超净工作台）
- 天平（精度0.1g）
- 均质器
- 灭菌锅（高压蒸汽灭菌器）
- 显微镜
- 无菌吸管（1mL、10mL）、移液器及无菌吸头
- 无菌培养皿、试管、三角瓶
- pH计
三、 详细检测步骤
(一) 样品前处理
- 无菌称取： 在生物安全柜内，用无菌剪刀和镊子，无菌称取10g（固体）或10mL（液体）代表性样品。
- 制备样液： 将样品放入装有90mL无菌稀释液（预热至40-45℃）的无菌均质袋或均质杯中。使用拍击式均质器充分均质（通常1-2分钟），制成1:10的初始样液。
- 梯度稀释： 用无菌吸管吸取1:10样液10mL，加入90mL无菌稀释液中，混匀，制成1:100样液。根据预期污染程度，可继续稀释至1:1000或更高。
(二) 增菌培养
- 取1:10样液10mL，加入到含90mL 7.5%氯化钠肉汤培养基的三角瓶中（相当于接种1g/mL样品）。
- 同时吸取1:10样液1mL，加入含9mL 7.5%氯化钠肉汤的试管中（相当于0.1g/mL样品）。
- 将接种后的三角瓶和试管置于36±1℃恒温培养箱中，培养24±2小时。
(三) 分离培养
- 取出增菌培养物，充分摇匀。
- 用无菌接种环分别挑取增菌液，在预先标记好的BP琼脂平板上划线分离（每个稀释度的增菌液至少接种一个平板）。
- 将平板倒置于36±1℃恒温培养箱中，培养24-48小时。
(四) 菌落观察与计数
- 培养后取出平板，观察菌落形态。
- 重点观察并记录符合以下特征的菌落（需描述颜色、大小、形态、有无沉淀环及晕环）：
- 圆形、光滑凸起、湿润。
- 直径通常2-3mm。
- 金黄色（有时为白色或奶油色）。
- 菌落周围有清晰的不透明白色沉淀环（卵磷脂酶阳性）。
- 菌落周围有明显的黄色晕环（甘露醇发酵阳性）。
- 计数具有上述典型特征的菌落在平板上的数量。选择菌落数在15-150 CFU之间的平板进行计数。若所有平板均无菌落生长，报告结果为未检出。
(五) 确证试验
对平板计数中观察到的典型疑似菌落，至少挑取5个（若少于5个则挑取全部）进行确证：
- 血浆凝固酶试验：
- 挑取单个疑似菌落，乳化于少量无菌生理盐水中，制成浓菌悬液。
- 吸取0.3mL兔（或人）血浆（恢复至室温）加入小试管。
- 加入0.1mL菌悬液，轻轻摇匀。
- 另取一管血浆，加入0.1mL无菌生理盐水作为阴性对照。
- 将两管置于36±1℃水浴或培养箱中。
- 每30分钟观察一次结果，持续4-6小时。阳性结果：血浆凝固成胶冻状（即使倒置试管也不流动）。阴性结果：血浆保持液态。
- 革兰氏染色与镜检：
- 挑取疑似菌落制片，进行革兰氏染色。
- 油镜观察：典型应为革兰氏阳性球菌，单个、成对、短链或典型的葡萄串状排列。
- 过氧化氢酶试验（可选，辅助确认）：
- 挑取少量菌苔置于洁净玻片上。
- 滴加一滴3% H₂O₂溶液。
- 阳性结果：立即产生大量气泡（氧气）。
(六) 结果判定
- 若确证试验中：
- 血浆凝固酶试验阳性。
- 革兰氏染色镜检符合典型形态（G⁺，球菌，葡萄状排列）。
- 菌落形态符合典型描述（尤其在BP平板上的沉淀环和晕环）。
- 则该菌落可确证为金黄色葡萄球菌。
- 根据确证为阳性的菌落数、稀释倍数和接种量，计算出每克（或每毫升）样品中金黄色葡萄球菌的数量（CFU/g 或 CFU/mL）。
- 计算公式：
样品中金黄色葡萄球菌数(CFU/g或CFU/mL) = (平板菌落数 × 确证阳性率) × 稀释倍数 / 接种量(g或mL)
* *确证阳性率：若挑取n个菌落做确证，有m个为阳性，则率=m/n。* * *稀释倍数：接种平板所用稀释液的稀释度。* * *接种量：通常指注入平板的稀释液体积（mL）。若平板接种的是1mL样液，则接种量为1mL。*
四、 结果报告
- 报告样品中金黄色葡萄球菌的定量结果：XX CFU/g 或 XX CFU/mL。
- 若在接种的增菌液和平板中均未分离确证出金黄色葡萄球菌，报告结果为：“未检出金黄色葡萄球菌”。
- 报告应清晰标注检测方法依据（GB 15979-2002）。
- 报告应包含样品信息（编号、名称、批号等）、检测日期、操作人员、培养条件和结果。
五、 质量控制与注意事项
- 无菌操作： 整个检测过程必须在无菌环境下（生物安全柜或超净工作台）进行，所有器材必须无菌，严防交叉污染。
- 培养基质控：
- 使用前检查培养基是否在有效期内，有无干裂、污染、变色。
- 定期对培养基进行无菌试验（未接种培养）和性能验证（使用标准菌株如金黄色葡萄球菌ATCC 6538验证其生长及典型特征）。
- 阳性与阴性对照：
- 阳性对照： 每次检测应同时接种已知的金黄色葡萄球菌标准菌株作为阳性对照，确保检测系统有效。
- 阴性对照： 使用无菌稀释液代替样品进行全程操作，作为阴性对照，确保无污染。
- 生物安全： 金黄色葡萄球菌为条件致病菌，操作应在生物安全二级(BSL-2)实验室进行，操作人员需穿戴个人防护装备（实验服、手套、口罩等），废弃物（培养基、接触过阳性样本的器具）需经121℃高压灭菌至少30分钟后再丢弃。
- 典型特征判断： 需严格依据菌落形态（尤其是BP平板上的沉淀环和晕环）以及血浆凝固酶试验阳性综合判定。非典型菌落或凝固酶阴性菌落需进一步鉴定（如API Staph等），但通常不作为报告对象。
- 样品代表性： 应严格按照抽样规程获取具有代表性的样品。
- 时效性： 样品采集后应尽快检测，如不能立即检测，应在冷藏条件下（2-8℃）保存，时间不超过24小时。
结论
对一次性卫生用品实施金黄色葡萄球菌的规范化检测，是保障产品卫生安全、防范健康风险不可或缺的技术屏障。严格执行国家标准GB 15979-2002规定的检测流程——从前处理、选择性增菌分离到形态学及血浆凝固酶关键确证——是获得准确、可靠检测结果的基础。检测实验室必须始终坚持严谨的质量控制体系和生物安全规范，确保数据的科学性和公信力。定期、有效地开展此项检测，能够及时发现潜在致病微生物污染，为生产企业改进工艺、监管部门评估风险、消费者放心使用提供坚实的科学依据，最终守护公共卫生安全底线。