一次性卫生用品大肠杆菌群检测

一次性卫生用品大肠杆菌群检测全流程指南

大肠杆菌群作为重要的卫生指示微生物，其存在于一次性卫生用品（如卫生巾、护垫、纸尿裤、湿巾、棉签等）中，直接关系到消费者的健康安全。规范、准确的检测是保障产品质量的关键环节。

一、检测原理与标准依据

检测基于大肠杆菌群在特定培养基和培养条件下生长、代谢产生酸性物质和/或β-葡萄糖醛酸酶分解显色底物产生特征性颜色变化或荧光反应的特性。主要依据国家标准 GB/T 27728-2020《一次性使用卫生用品卫生要求》 附录B规定的大肠杆菌群检测方法（滤膜法/MPN法）。

二、检测前准备

1. 环境要求： 检测须在符合要求的无菌室或超净工作台中进行，环境洁净度应达到万级，操作台局部百级。使用前需紫外灯照射消毒30分钟以上，并用75%酒精擦拭台面。
2. 仪器设备：
   • 恒温培养箱（(36±1)℃ 和 (44.5±0.5)℃）
   • 恒温水浴箱（(44.5±0.5)℃）
   • 电子天平（精度0.1g）
   • 均质器或拍打式均质袋
   • 无菌吸管（1mL, 10mL）或移液器及无菌吸头
   • 无菌培养皿
   • 无菌锥形瓶（250mL, 500mL）
   • 无菌刻度试管（18mm×180mm）
   • 滤膜过滤装置（孔径0.45μm的滤膜）
   • 微生物限度检测仪（若使用滤膜法）
   • 紫外灯（波长365nm，用于MUG试验观察荧光）
3. 培养基与试剂：
   • 无菌生理盐水（0.85-0.90% NaCl）或磷酸盐缓冲液（PBS）
   • 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）
   • 大肠菌群显色培养基（选择性显色培养基，如ChromID Coli Agar等，按说明书配制）
   • 营养琼脂培养基（NA）或平板计数琼脂（PCA）
   • 革兰氏染色试剂
   • 靛基质试剂（柯凡克试剂）
   • EC肉汤（含MUG，4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷）
   • 无菌稀释液（如蛋白胨水）

三、样品采集与处理

1. 采样： 按GB 15979《一次性使用卫生用品卫生标准》规定进行抽样。样品应在无菌条件下采集，置于无菌袋或容器中，标识清晰（样品名称、批号、采样日期等）。运输过程需保持冷藏（2-8℃），尽快送检（通常不超过24小时）。
2. 样品处理（无菌操作）：
   • 非液体样品（卫生巾、护垫、纸尿裤、棉签等）： 无菌操作称取10g样品（精确至0.1g），剪碎后放入装有90mL无菌稀释液（如蛋白胨水或生理盐水）的均质袋或锥形瓶中。使用拍打式均质器剧烈振荡1-2分钟或均质器均质1-2分钟，制成1:10的样品匀液。
   • 液体样品（湿巾挤出液、护理液等）： 无菌操作量取10mL样品，加入90mL无菌稀释液中，混匀，制成1:10的样品匀液。
   • 后续稀释： 根据需要，用无菌吸管吸取1:10匀液1mL，注入9mL无菌稀释液中，混匀成1:100匀液。同法制备1:1000、1:10000等稀释度。

四、检测方法（以GB/T 27728-2020 滤膜法为主，简述MPN法）

• 滤膜法（推荐）：

  1. 过滤： 选择适宜稀释度的样品匀液（通常为原液或1:10），充分混匀后，无菌操作吸取一定体积（通常1mL或10mL，具体依据预期污染程度和标准要求）注入已灭菌的滤器漏斗中。启动抽滤装置，通过孔径为0.45μm的无菌滤膜进行抽滤。
  2. 冲洗： 用适量（如20-30mL）无菌生理盐水或缓冲液冲洗滤器内壁，抽干。
  3. 转移与培养： 无菌操作将滤膜转移至已倾注并凝固的大肠菌群显色培养基平板上（有菌落生长面朝上），确保滤膜与培养基紧密贴合无气泡。或转移至已倾注并凝固的营养琼脂平板上，再覆盖一层约5mL的LST肉汤（或直接使用含吸收垫的滤膜培养系统）。
  4. 初发酵/培养： 将平板倒置放入(36±1)℃恒温培养箱中培养(24±2)小时。
  5. 结果观察：
     • 显色培养基： 观察滤膜上生长的菌落。典型大肠杆菌群菌落通常呈现特定的颜色（如蓝色、蓝绿色、紫红色等，具体取决于所用显色底物）。计数特征性菌落数。
     • 营养琼脂+LST覆盖法： 观察滤膜上生长的菌落，计数所有菌落总数。同时，观察LST肉汤是否产气（小倒管内收集有气泡）。
  6. 复发酵/验证试验（必要时）： 挑取滤膜上5个（或按标准规定数量）特征性菌落或可疑菌落（若使用营养琼脂+LST法，则挑取产酸产气的菌落），分别转种于LST肉汤管和营养琼脂斜面上。(36±1)℃培养(24±2)小时。LST产气者，进行革兰氏染色和靛基质试验（I）：
     • 革兰氏染色：镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌。
     • 靛基质试验：挑取上述菌苔接种于蛋白胨水培养基，(36±1)℃培养(24±2)小时后，沿管壁缓慢加入柯凡克试剂0.3-0.5mL，液面交界处出现玫瑰红色环为阳性（+）。
     • 符合革兰氏阴性无芽孢杆菌、LST产气、靛基质阳性者，判定为大肠杆菌群阳性。
  7. 计算报告： 统计滤膜上经确证的大肠杆菌群阳性菌落数。根据过滤的样品体积和稀释倍数，计算每克（或每毫升）样品中大肠杆菌群的数量，以CFU/g（或CFU/mL）报告。公式：大肠杆菌群数(CFU/g或mL) = (平均阳性菌落数 × 稀释倍数) / 过滤体积(mL) * 样品单位(g或mL)。

• MPN法（最大可能数法）：

  1. 接种与初发酵： 选择3个适宜稀释度（如1:10, 1:100, 1:1000），每个稀释度接种3管LST肉汤。每管接种量为1mL（液体样品）或1g（非液体样品需用匀液）。将接种管置于(36±1)℃培养箱中培养(48±2)小时，观察小倒管产气情况。产气者记录为初发酵阳性。
  2. 复发酵与验证： 将所有初发酵阳性的LST管，用接种环转种至EC-MUG肉汤管中。将EC-MUG管置于(44.5±0.5)℃水浴或培养箱中培养(24±2)小时。
  3. 结果观察：
     • 观察EC-MUG管小倒管产气。
     • 在暗室中用365nm波长紫外灯照射EC-MUG管，观察蓝色荧光（MUG分解产生）。
  4. 判定： 同时满足 产气 和 荧光阳性 的EC-MUG管，判定为大肠杆菌群阳性。
  5. 查表与报告： 根据3个稀释度9管中呈阳性的管数组合，查对GB/T 27728-2020附录B提供的MPN检索表，得出每克（或每毫升）样品中大肠杆菌群的最大可能数（MPN值），以MPN/g（或MPN/mL）报告。

五、结果报告与判定

• 详细记录检测方法、样品信息、检测条件、各步骤观察结果、阳性管数/菌落数、计算过程。
• 根据GB 15979《一次性使用卫生用品卫生标准》规定：
  • 普通级产品： 大肠菌群不得检出。
  • 消毒级产品： 大肠菌群不得检出。
  • 报告结果为“检出”或“未检出大肠杆菌群”，或报告具体数值（CFU/g/mL 或 MPN/g/mL）。

六、质量控制要点

1. 培养基质控： 使用前需进行无菌试验和灵敏度试验（用阳性/阴性标准菌株验证）。
2. 环境监控： 定期进行无菌室沉降菌、表面微生物监测。
3. 人员操作： 严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
4. 方法验证： 对新方法或重要变更进行方法适用性验证。
5. 加标回收： 定期进行阳性样品加标回收试验，监控检测系统准确性。
6. 空白对照： 每次检测需同时进行稀释液、培养基、滤器/吸管等的无菌空白对照试验。
7. 样品代表性： 确保样品充分混匀，取样具有代表性。
8. 温度控制： 水浴箱和培养箱温度必须精确控制并记录，尤其是(44.5±0.5)℃对结果至关重要。

七、检测意义

对一次性卫生用品进行严格的大肠杆菌群检测，具有重大意义：

• 保障消费者健康： 有效防止因产品微生物污染导致的感染或健康风险，尤其是女性经期及婴幼儿等敏感人群。
• 监控生产卫生： 反映原料、生产环境、工艺流程、人员操作、仓储运输等环节的卫生控制水平，是企业质量管理的重要指标。
• 符合法规要求： 满足国家强制性卫生标准（GB 15979）和推荐性检测方法标准（GB/T 27728）的要求，是产品合法上市销售的前提。
• 提升企业信誉： 持续稳定的合格检测结果是产品质量可靠性的证明，增强消费者信心和品牌声誉。
• 促进产业升级： 推动生产企业不断改进生产工艺、加强质量控制，提升行业整体卫生安全水平。

通过严格执行标准化的检测流程和严格的质量控制措施，可确保一次性卫生用品中大肠杆菌群检测结果的科学性和准确性，为产品质量安全提供坚实保障，最终服务于公共健康事业。