一次性卫生用品细菌菌落总数检测：流程与意义
引言
一次性卫生用品（如卫生巾、护垫、纸尿裤、湿巾、纸巾等）直接接触人体皮肤或粘膜，其卫生质量直接关系到使用者的健康安全。细菌菌落总数作为评价产品微生物污染程度的基础指标，是衡量产品卫生质量、反映生产环境卫生控制水平以及评估产品储存期寿命的重要依据。严格规范的细菌菌落总数检测，是保障消费者健康不可或缺的环节。
一、 检测对象与意义
- 对象： 各类一次性使用卫生用品及其原材料（如无纺布、绒毛浆、高分子吸水树脂等）。
- 意义：
- 评估卫生状况： 反映产品受到细菌污染的程度。
- 监控生产过程： 发现生产、包装、储存环节中的卫生隐患。
- 确保产品安全： 防止因微生物超标导致使用者感染、过敏等问题。
- 符合法规要求： 满足国家强制性标准（如GB 15979《一次性使用卫生用品卫生标准》）及相关法规对微生物限量的规定。
- 指导质量控制： 为企业制定和改进质量控制措施提供数据支持。
二、 检测原理与标准依据
- 原理： 利用微生物在适宜的营养基和生长条件下繁殖形成肉眼可见菌落的特性。将待测样品处理后接种于固体培养基，经过规定时间和温度的培养，计数培养基上长出的菌落数量（CFU - Colony Forming Units），从而计算出单位质量或面积样品中所含的需氧性嗜温细菌总数。
- 主要标准依据（中国）：
- GB 15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准》：规定了各类产品的微生物指标限量（普通级产品：细菌菌落总数 ≤ 200 CFU/g 或 CFU/mL；消毒级产品：细菌菌落总数 ≤ 20 CFU/g 或 CFU/mL）。
- GB/T 7918.1-1987 《化妆品微生物标准检验方法 细菌总数测定》：提供了化妆品中细菌总数测定的基础方法，其基本原理和操作步骤广泛应用于一次性卫生用品的检测（常结合产品标准进行具体调整）。
- 相关产品标准： 如GB/T 8939（卫生巾）、GB/T 20810（卫生纸）等，会重申或引用微生物检测方法。
三、 实验材料与设备
- 培养基： 营养琼脂培养基（适用于需氧和兼性厌氧菌的培养），需按标准配制、灭菌并验证无菌性及适用性。
- 稀释液： 无菌生理盐水（0.85%-0.9% NaCl 溶液）或磷酸盐缓冲液（PBS），用于样品的稀释。
- 主要仪器设备：
- 无菌操作台（生物安全柜或超净工作台）
- 恒温培养箱（通常设定为 (36±1)℃）
- 高压蒸汽灭菌器
- 恒温水浴箱（用于溶解或保温培养基）
- 天平（精度至少为 0.001g）
- 无菌均质器或拍打式均质器（带无菌均质袋）
- 无菌吸管（1mL, 10mL）或移液器（配备无菌吸头）
- 无菌培养皿（直径通常为 90mm）
- 无菌锥形瓶（用于配制和储存培养基、稀释液）
- 酒精灯或红外灭菌器
- 菌落计数器（或放大镜、记号笔）
- 无菌耗材： 无菌剪刀、镊子、取样袋等。
四、 检测流程（详细步骤）
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实验前准备：
- 彻底清洁消毒实验室环境及操作台面。
- 将所有培养基、稀释液、培养皿、吸管/吸头、均质袋等必要器材灭菌备用。
- 开启无菌操作台，紫外灭菌至少30分钟，使用前用75%酒精擦拭台面并通风运行。
- 将恒温培养箱预热至设定温度（(36±1)℃）。
- 准备好待测样品，确保包装完整无损。
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样品采集与处理：
- 取样： 在无菌条件下随机抽取足够数量的代表性样品。若需检测内层材料，需无菌操作打开包装。
- 称取/量取： 对于固体样品（如卫生巾、纸尿裤芯体、无纺布），用无菌剪刀和镊子剪取一定量（通常为10g ± 0.1g）具有代表性的样品，放入装有90mL无菌稀释液（预热至约40-45℃）的无菌均质袋中。对于液体样品（如湿巾挤出液），直接用无菌吸管吸取10mL样品，加入90mL无菌稀释液中（即10倍稀释）。
- 均质： 将装有样品和稀释液的均质袋放入拍打式均质器中，按规定时间和速度（通常1-2分钟）进行均质，使样品均匀分散，释放微生物。此步得到10⁻¹（1:10）的样品匀液。
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梯度稀释：
- 用无菌吸管或移液器吸取1:10的样品匀液1mL，注入装有9mL无菌稀释液的试管中（注意吹吸混匀），此为10⁻²（1:100）稀释液。
- 同法，依次制备10⁻³（1:1000）、10⁻⁴（1:10000）等更高梯度的稀释液（根据预期污染程度选择至少2-3个适宜稀释度进行接种）。每次稀释更换无菌吸管/吸头。
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倾注平板接种：
- 选择2-3个适宜的连续稀释度（通常选取能使最终平板上长出30-300 CFU菌落的稀释度）。
- 用无菌吸管或移液器吸取1mL选定稀释度的稀释液，注入无菌培养皿中。
- 每个稀释度做2-3个平行样（即重复2-3个培养皿）。
- 立即将事先融化并冷却至45-50℃的营养琼脂培养基倾注入培养皿内（每皿约15-20mL）。
- 迅速在台面轻轻旋转平皿，使样液与培养基充分混匀，避免产生气泡。
- 同时设置空白对照：取1mL无菌稀释液注入平皿，倾注培养基，用于检查培养基及操作过程是否无菌。
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培养：
- 待培养基完全凝固后，将平皿倒置（防止冷凝水滴落影响菌落生长和计数），放入恒温培养箱中。
- 培养条件： (36 ± 1)℃恒温培养 (48 ± 2)小时。
- 培养过程中避免振动。
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菌落计数：
- 培养结束后，立即取出平皿进行计数。如不能立即计数，应置于4℃冰箱内暂存（不超过24小时）。
- 选取菌落数在30-300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板作为计数对象。低于30 CFU时记录实际数量；高于300 CFU时可记录为“多不可计”（TMTC），并选取更高稀释度平板计数。
- 使用菌落计数器或放大镜进行计数，必要时用记号笔点计。
- 计数所有肉眼可见的菌落。
- 若同一稀释度的两个平行平板的菌落数相差过大（如超过一倍），需分析原因并可能需重做。
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结果计算与报告：
- 计算原则： 选取平均菌落数在30-300 CFU之间的稀释度进行计算。
- 公式： 细菌菌落总数 (CFU/g 或 CFU/mL) = (平板上平均菌落数 × 稀释倍数) / 取样量(g或mL)
- 示例： 若10⁻³稀释度平板平均菌落数为65，则细菌菌落总数 = (65 × 1000) / 10 = 6500 CFU/g（固体样品）。
- 报告： 结果报告为细菌菌落总数（CFU/g）或（CFU/mL），并注明检测依据的标准（如GB 15979）。结果通常保留两位有效数字，如16000可报告为1.6 × 10⁴ CFU/g。若所有平板均无菌落生长，报告为<1倍最低稀释倍数（如<10 CFU/g）；若仅最低稀释度平板菌落数<30，报告实测值。
五、 质量控制要点
- 无菌操作： 整个取样、稀释、接种过程必须在严格无菌条件下进行，避免引入外源性污染。
- 培养基质量： 使用符合标准的培养基，定期验证其无菌性、pH值和促生长能力。
- 稀释均匀性： 确保每次稀释充分混匀。
- 培养温度与时间： 严格控制培养箱温度在(36±1)℃，培养时间(48±2)小时。
- 平板凝固： 倾注培养基温度适中（45-50℃），过高会杀死微生物，过低易凝固导致混合不均。
- 平行试验： 每个稀释度设置平行样，取其平均值，确保结果可靠性。
- 空白对照： 必须设置空白对照，若空白对照平板有菌落生长，则实验无效，需查明原因重做。
- 人员操作： 实验人员需经过专业培训，熟悉标准操作规范。
- 仪器检定： 定期对天平、培养箱、移液器等关键仪器进行检定或校准。
六、 结果解读与判定
将计算得出的细菌菌落总数与产品所执行标准（如GB 15979）规定的限量值进行对比：
- 普通级产品：细菌菌落总数 ≤ 200 CFU/g 或 CFU/mL 为合格。
- 消毒级产品：细菌菌落总数 ≤ 20 CFU/g 或 CFU/mL 为合格。
- 超出限量值即判定为不合格产品。
七、 局限性
菌落总数测定主要反映样品中在特定条件下（需氧、嗜温、营养琼脂）可生长的活菌数量，并不能区分具体的细菌种类（如致病菌和非致病菌），也无法检测厌氧菌、特殊营养要求菌或处于“活的非可培养状态（VBNC）”的细菌。因此，对于特定风险（如致病菌污染）的评估，还需结合其他针对性更强的微生物检测指标（如大肠菌群、致病性化脓菌、真菌等）。
结论
细菌菌落总数检测是监控一次性卫生用品卫生质量的核心手段。遵循标准化的操作流程，严格控制实验条件和质量环节，才能获得准确可靠的检测结果。这不仅是生产企业履行质量主体责任、保障消费者健康安全的关键措施，也是市场监管部门进行产品质量监督抽查的重要技术支撑。持续优化生产过程卫生控制，严格执行出厂检验，确保产品符合国家卫生标准，是提升一次性卫生用品行业整体质量水平和消费者信心的根本途径。