蒸汽甲醛低温灭菌生物指示剂测试指南
蒸汽甲醛低温灭菌（LTSF）技术凭借其优异的材料兼容性和低温特性（通常50°C-65°C），已成为处理热敏精密医疗器械（如内窥镜、电子元件、塑料制品等）的核心灭菌手段。为确保每次灭菌过程都能达到有效杀灭所有微生物的目标，生物指示剂（BI）测试是不可或缺的最终验证环节。本文旨在系统地介绍LTSF生物指示剂测试的原理、方法、结果判读及关键质量控制点。
一、 生物指示剂：灭菌效果的直接代言者
- 核心原理： 生物指示剂内含已知数量、对特定灭菌方式具有高度抵抗力的标准化微生物孢子（通常为嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子，Geobacillus stearothermophilus）。这些孢子经过严格筛选和培养，其抗性远高于日常灭菌物品上可能存在的一般病原体和污染物。
- 作为挑战载体： 在灭菌过程中，生物指示剂被放置于灭菌舱内最具挑战性的位置（最难被灭菌剂穿透或杀灭的部位）。如果灭菌过程成功杀灭了这些最具抗性的孢子，则可以合理推断灭菌过程也足以杀灭负载上污染的所有微生物。
- 定量评估： 合格的生物指示剂具有已知的初始孢子数量（通常在10⁵至10⁶ CFU/单位）和特定的D值（在特定条件下杀灭90%孢子所需的时间）。这使得生物指示剂不仅能定性判断灭菌成败（有菌/无菌），还能为灭菌程序的优化提供定量依据。
二、 蒸汽甲醛低温灭菌生物指示剂测试操作流程
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测试前准备：
- 确认灭菌程序： 明确将要验证的LTSF灭菌程序的详细参数（温度、甲醛浓度、湿度、真空/加压次数及时间、总循环时间等）。
- 选择合格生物指示剂： 选用明确标示适用于蒸汽甲醛低温灭菌程序且仍在有效期内的高品质生物指示剂。仔细阅读说明书，了解其孢子种类、数量、D值、培养条件和有效期。
- 准备对照：
- 阳性对照： 准备至少1个同批次、未经过灭菌处理的生物指示剂。
- 阴性对照： 准备1个无菌培养基管（确保未接种任何微生物）。
- 确定放置位置： 依据灭菌器厂商建议或验证方案，识别灭菌舱内最难灭菌的位置（通常参考物理、化学监测挑战包的设计或灭菌器性能鉴定结果）。常见位置包括灭菌舱排水口附近、大型器械管腔内部、多层包裹物品中心、大容量液体容器底部等。
- 装载模拟： 将生物指示剂放入模拟常规处理的灭菌挑战包内（包含最难灭菌的器械或物品），然后遵循常规装载规范将挑战包置于预定最难灭菌的位置。每次测试应至少使用一个生物指示剂。
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执行灭菌过程：
- 按照标准操作规程装载灭菌器。
- 选择并运行指定的蒸汽甲醛低温灭菌程序。
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灭菌后处理与生物指示剂转移：
- 灭菌循环结束后，遵循安全规程进行充分的通风排气，确保残留甲醛降至安全限值以下后再打开舱门。
- 立即取出： 在灭菌循环结束后，应尽快（通常建议在30分钟内）小心地从挑战包中取出生物指示剂。避免剧烈晃动。
- 标识与记录： 清晰标识每个取出的生物指示剂对应的灭菌器号、循环号、日期时间和放置位置。同时记录灭菌循环的关键参数日志。
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生物指示剂培养：
- 激活培养基： 按照生物指示剂说明书要求，压碎或挤破内含的培养基安瓿（如有），使培养基充分浸润含有孢子的载体条。
- 设置培养条件： 将处理过的生物指示剂连同阳性对照和阴性对照，一同放入专用的恒温培养设备中。
- 温度与时间： 严格遵循说明书要求设定培养温度（通常是55°C-60°C）和培养时间（通常为24小时或48小时）。某些自含式快速生物指示剂可能采用荧光检测法，培养时间显著缩短（如1-3小时）。
- 避免混淆： 确保生物指示剂和对照标识清晰，培养过程中位置固定，避免混淆。
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结果观察与判读（终点判读）：
- 在预设的培养时间结束时，取出所有生物指示剂和对照。
- 目视检查（颜色变化型）：
- 阴性结果（灭菌成功)： 测试生物指示剂管内培养基保持原有颜色（通常为紫色）不变（即无菌生长）。
- 阳性结果（灭菌失败)： 测试生物指示剂管内培养基变为黄色（或其他指示阳性生长的颜色变化）。孢子存活并生长产酸导致颜色变化。
- 仪器判读（荧光检测型）： 将生物指示剂放入专用阅读器，仪器自动检测荧光信号变化。
- 阴性结果（灭菌成功)： 仪器显示“通过”或“无菌生长”。
- 阳性结果（灭菌失败)： 仪器显示“失败”或“有菌生长”。
- 对照结果验证：
- 阳性对照： 必须显示阳性（颜色变化/仪器报失败），证明孢子具有活性且培养基能支持生长。若阳性对照未生长，则本次测试无效。
- 阴性对照： 必须显示阴性（颜色不变/仪器报通过），证明培养基无菌。若阴性对照显示阳性，则本次测试无效。
三、 结果解释与后续行动
- 测试通过（所有测试生物指示剂阴性)： 结合物理监测（时间、温度、压力曲线）和化学监测（包内、包外指示物）合格的结果，该次灭菌循环通过生物监测验证，灭菌物品理论上可以放行使用（需遵循机构放行政策）。生物指示剂测试结果记录存档。
- 测试失败（任一测试生物指示剂阳性)：
- 立即暂停放行： 所有在该失效循环中处理的物品均不得放行使用，必须视为未灭菌。
- 隔离物品： 立即查找并隔离该次循环处理的所有物品。
- 检查物理/化学监测： 回顾灭菌循环的物理记录图和化学指示物结果，分析可能导致失败的原因。
- 启动故障调查： 系统调查可能的原因，包括但不限于：
- 灭菌器故障（如真空度不足、泄漏、温度失控、甲醛注入失败、湿度异常）。
- 灭菌程序参数选择不当。
- 生物指示剂失效（过期、储存不当、运输损坏）。
- 生物指示剂放置位置错误或未置于最难灭菌点。
- 灭菌前清洁不彻底，有机负载过高影响灭菌剂渗透。
- 装载过密或阻碍灭菌剂穿透。
- 灭菌后通风排气不足导致甲醛残留影响生物指示剂。
- 培养过程错误（温度不准、时间不足、培养基未激活）。
- 阳性生物指示剂确认： 有时需对阳性生物指示剂进行确认培养或实验室鉴定，排除假阳性（如操作污染）。
- 复测： 在查明并纠正故障原因后，必须使用同一灭菌程序，在同一台灭菌器上，用新的生物指示剂进行连续三次空载（即不放任何器械物品）生物指示剂测试。三次测试必须全部通过才能认为该灭菌器及程序恢复可用。
- 追溯与通知： 若在测试失败后已有物品被误放行使用，需立即启动追溯程序，评估风险并通知相关人员。
- 记录与报告： 详细记录测试失败情况、调查过程、采取的措施及复测结果，按规定上报。
四、 关键质量控制与注意事项
- 生物指示剂管理：
- 合规性： 确保选用的生物指示剂遵循国家相关规定并适用于蒸汽甲醛灭菌。
- 有效期： 严格在有效期内使用。过期生物指示剂抗性下降，结果不可靠。
- 储存条件： 严格按照说明书要求储存（通常阴凉干燥处，避免冷冻、高温、阳光直射）。
- 运输： 防止剧烈震动和极端温度。
- 批次记录： 记录生物指示剂的批号和有效期。
- 灭菌过程控制：
- 装载规范： 严格遵守装载指南，避免过载和阻挡灭菌剂穿透。
- 设备维护： 执行预防性维护计划，确保灭菌器处于良好工作状态。定期进行性能鉴定（PQ）。
- 参数监控： 实时监控并记录灭菌循环关键参数，确保符合程序设定。
- 清洁与干燥： 物品灭菌前必须彻底清洗、漂洗和干燥，减少有机物和无机盐负荷。
- 生物测试操作：
- 放置位置： 准确放置在预定最难灭菌点。
- 及时转移： 灭菌后尽快取出进行培养，避免长时间高温或残留甲醛影响。
- 规范操作： 严格按照生物指示剂说明书和实验室规范操作，避免污染。
- 对照设置： 每次测试必须同时设置有效的阳性对照和阴性对照。
- 培养条件： 确保培养设备温度准确稳定，培养时间充足。
- 频率要求：
- 常规监测： 遵循行业规范（如WS310.3）和机构政策执行。通常要求每周至少一次监测，且每台灭菌器每周均应进行监测。
- 植入物监测： 对于植入性器械的灭菌，每批次均需进行生物监测，结果阴性后方可放行（紧急情况遵循特定放行程序）。
- 特殊情形： 新灭菌器启用前、灭菌器大修后、程序重大变更后、灭菌失败整改后等，均需进行额外的生物监测验证。
- 人员培训： 所有操作人员须经过严格培训和考核，熟练掌握灭菌器操作、生物指示剂测试流程、结果判读及应急处理程序。
- 安全防护： 处理甲醛、操作灭菌器及接触生物指示剂（尤其是阳性结果）时，务必穿戴适当的个人防护装备（手套、口罩、护目镜、防护服），并严格遵守相关安全规程。确保工作区域通风良好。
- 记录完整性： 详细、准确、及时地记录所有与灭菌过程、生物指示剂测试相关的信息（灭菌参数、生物指示剂类型批号、放置位置、培养时间温度、结果判读、操作者签名等），确保可追溯性。记录应妥善保存规定年限。
结论：
蒸汽甲醛低温灭菌生物指示剂测试是保障灭菌有效性的核心环节，也是医疗器械再处理质量控制的基石。通过采用标准化的高抗性微生物孢子挑战，并将其置于灭菌过程的最严苛位置，生物指示剂为判断无菌保障水平提供了直接的生物学证据。严格遵守规范的测试流程——包括正确的生物指示剂选择与管理、精准的放置、及时的培养、严谨的对照设置以及准确的结果判读——是获得可靠结果的前提。对于失败的测试结果，必须立即采取停止放行、调查原因、纠正问题和连续三次合格复测等严格措施，以确保患者安全。建立完善的质量管理体系，涵盖人员培训、设备维护、过程监控、记录保存和安全防护，是成功实施生物指示剂测试并最终确保低温灭菌安全有效的根本保障。
注意： 本文内容基于灭菌技术通用原则和实践指南编写。具体操作务必严格遵循您所在机构制定的标准操作规程（SOP）、国家/地区的相关法规以及所使用的灭菌设备和生物指示剂的制造商说明书。