汽化过氧化氢灭菌生物指示剂测试

发布时间：2025-07-01 16:05:04 阅读量：1 作者：生物检测中心

汽化过氧化氢灭菌生物指示剂测试：原理、应用与重要性

汽化过氧化氢（Vaporized Hydrogen Peroxide, VHP）灭菌技术凭借其优异的灭菌效果、材料兼容性、无残留及操作安全性，已成为医疗、制药、生物安全实验室等领域广泛采用的关键灭菌方法。为了科学验证和持续监测VHP灭菌过程的有效性，生物指示剂（Biological Indicator, BI） 测试是不可或缺的核心环节。

一、 汽化过氧化氢（VHP）灭菌原理简述

VHP灭菌的本质是利用过氧化氢（H₂O₂）在特定条件下气化后产生的自由羟基（•OH）。这些具有极高氧化电位的自由基能迅速破坏微生物的关键细胞结构：

  1. 细胞膜脂质： 导致膜结构崩解。
  2. 蛋白质（酶）： 使其变性失活。
  3. 核酸（DNA/RNA）： 造成断裂，阻止其和功能发挥。
    这一过程可在相对较低的温度（通常室温至60°C）下实现，对热敏物品尤为友好。
 

二、 生物指示剂（BI）的核心作用与构成

生物指示剂是专门设计、负载有特定数量标准微生物孢子的测试系统。在VHP灭菌效果确认中，BI扮演着“最严苛挑战者”的角色：

  • 核心目的： 直接证明灭菌过程是否足以灭活最具抗性的微生物，从而确保整个装载物品的无菌保障水平（Sterility Assurance Level, SAL）达到预设标准（通常为10^-6）。
  • 关键组分：
    1. 标准测试微生物： 嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）孢子是国际公认的VHP灭菌生物指示剂菌种。其孢子对VHP具有已知且稳定的强抵抗力，远超过常见环境微生物和病原体。
    2. 高浓度孢子负载： BI通常含有≥1.0 × 10⁶ CFU（菌落形成单位）的靶标孢子，提供巨大的挑战强度。
    3. 载体： 孢子被均匀、稳定地负载在惰性载体（如不锈钢片、纸片、特殊聚合物）上。
    4. 防护外壳（可选）： 部分BI设计有防护结构（如玻璃或塑料管），既保护孢子免受物理损伤，又可模拟灭菌剂穿透抗性（如用于BD测试）。
    5. 培养介质： 配套含有特定营养物质的培养基（通常为含pH指示剂的胰酪胨大豆肉汤），用于灭菌后的孢子复苏培养和结果判读。
 

三、 生物指示剂测试标准流程

规范化的BI测试是结果可靠性的基石：

  1. BI选择与放置：

    • 严格依据待验证灭菌设备、程序（如灭菌浓度、时间、温湿度）以及相关法规/标准（如ISO 11138系列、ISO 14937、USP <1229.11>）选择符合要求的BI。
    • 战略布点： 将BI放置于灭菌腔室内最难灭菌的位置（灭菌剂最难穿透或浓度最低处）。典型位置包括：
      • 灭菌设备排气口附近。
      • 大型设备或管道内部深处。
      • 物品包装袋/容器内部中心。
      • 堆放物品的底层中心和角落。
      • 密封器械的管腔内部（需使用专门设计的管腔BI）。
    • 数量要求： 每批次至少放置一个BI。验证研究或关键灭菌批次通常需放置更多（如≥3个），以提高代表性并符合统计学要求。

  2. 运行灭菌循环：

    • 按照经过验证并批准的标准操作规程（SOP）启动完整的VHP灭菌程序。

  3. BI回收与处理：

    • 灭菌循环结束后，在无菌条件下小心取出BI。
    • 若BI有防护外壳，需严格按照说明书将其挤压或激活，使孢子载体落入培养液内。

  4. 培养：

    • 将处理后的BI（或孢子载体+培养液单元）放入专用培养箱。
    • 培养条件：嗜热脂肪地芽孢杆菌需在55-60°C下培养。
    • 培养时间：通常为24小时至7天（具体时间依据产品说明和验证要求）。提前判读（如24h/48h）可快速筛查，延长培养（如7天）确保无迟滞生长。

  5. 结果分析与判读：

    • 阳性对照： 需同时培养一支未经灭菌处理的同批次BI，必须显示生长（培养液变浑浊且通常伴随颜色变化→阳性），证明孢子存活且培养系统有效。
    • 阴性对照： 需设置一支仅含无菌培养基的对照管，必须无生长（澄清→阴性），证明培养基无菌且未被污染。
    • 测试BI判读：
      • 合格（灭活成功）： 所有经过灭菌处理的BI均无微生物生长（培养液保持澄清）。表明灭菌过程在该位置达到了预定杀灭效果（如杀灭≥6 log₁₀孢子）。
      • 不合格（灭菌失败）： 任何一支经过灭菌处理的BI显示微生物生长（培养液变浑浊/颜色变化）。表明该位置的灭菌条件不足以杀灭所有指示孢子，灭菌过程失败，物品不可放行使用。
 

四、 BI测试的关键性能参数与验证

  • D值（Decimal Reduction Value）： 在特定灭菌条件下，杀灭90%（1个对数单位）靶标微生物所需的时间（分钟）。是衡量孢子抗性和灭菌效率的核心参数。
  • Z值： D值变化10倍（1个对数单位）所需的温度或浓度变化量（°C或μg/L）。反映灭菌参数微小变化对杀灭效果的影响程度。
  • 存活时间（Survival Time, ST）： 在特定灭菌条件下，所有测试BI仍能显示孢子生长的最长处理时间。应小于灭菌程序设定的最小暴露时间。
  • 杀灭时间（Kill Time, KT）： 在特定灭菌条件下，所有测试BI均显示无孢子生长的最短处理时间。应小于或等于灭菌程序设定的最小暴露时间。
  • 孢子计数（Population）： BI出厂时标定的活孢子数量（通常≥1.0 × 10⁶ CFU）。
  • 稳定性（保质期）： BI在指定储存条件下保持标称孢子数量和抗性的时间。
 

五、 生物指示剂测试的核心重要性

  1. 过程有效性的直接证明： BI提供微生物学证据，直接证明VHP灭菌工艺在特定装载、特定位置达到了预设的无菌保证水平（SAL 10^-6），而非依赖物理/化学参数的间接推测。
  2. 识别“冷点”： 通过在不同位置放置BI，精准定位灭菌循环中灭菌剂最难到达或效果最弱的区域（冷点），为工艺优化和设备维护提供依据。
  3. 日常监控与放行依据： 在关键灭菌批次（如无菌药品生产、植入器械灭菌）中，BI测试结果是物品能否放行使用的决定性依据之一。
  4. 验证与再验证的核心： 新灭菌设备、新程序、重大变更（如装载方式改变）后，BI测试是灭菌工艺验证（IQ/OQ/PQ）和周期性再验证的核心组成部分。
  5. 符合法规的强制要求： 全球主要药品生产质量管理规范（GMP）、医疗器械质量管理体系（ISO 13485）及相关灭菌标准（ISO 11135, ISO 14937, AAMI ST58/ST65等）均强制要求使用BI进行灭菌效果确认。
  6. 提供最高级别安全保障： 使用最具抗性的孢子进行挑战，提供了应对实际污染物中可能存在的高抗性微生物的最高安全保障。
 

结论：

汽化过氧化氢灭菌生物指示剂测试是确保VHP灭菌工艺有效性和可靠性的基石。通过精心选择标准化、高抗性的嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子指示剂，并将其战略性地布放在灭菌舱的最难灭菌位置，BI测试提供了无可替代的直接微生物学证据。严格遵守规范的测试流程和结果判读标准，对于保障患者安全、产品质量合规以及满足严格的国际法规要求至关重要。将BI测试纳入VHP灭菌周期验证和日常监控程序，是构建健全无菌保障体系的必备环节。