干热灭菌生物指示剂测试：原理与应用指南
干热灭菌是利用高温干热空气杀灭微生物的可靠方法，广泛应用于制药、医疗器械及实验室中耐热物品的灭菌。为确保灭菌过程的有效性，生物指示剂（BIs） 作为直接挑战灭菌条件的工具，是验证和日常监控的核心环节。以下为干热灭菌生物指示剂测试的全面解析：
一、 干热灭菌原理与挑战
- 作用机制： 主要通过氧化作用破坏微生物细胞的基本结构（如蛋白质、核酸），导致其死亡。不同于湿热灭菌（蒸汽）的蛋白质变性，干热灭菌所需温度更高、时间更长。
- 典型应用场景：
- 玻璃器皿（注射剂瓶、安瓿瓶）
- 金属器械（手术器械、针头）
- 油剂、粉剂等不耐湿热的物料
- 去除热原（内毒素）过程（通常要求更高温度，如≥250℃）
- 关键灭菌参数： 温度 (
T) 和时间 (t) 是决定灭菌效果的核心因子。常见程序包括：- 160-180℃：持续数小时（如 160℃ ≥ 2小时）
- 去热原程序：≥250℃，持续数十分钟（如 250℃ ≥ 30分钟）
二、 生物指示剂（BIs）的核心作用
生物指示剂是含有已知高耐受性、标准数量（通常≥10⁶）的特定微生物孢子的载体。在干热灭菌验证中，BI被置于灭菌设备最难灭菌的位置（冷点），直接挑战灭菌条件是否足以杀灭所有微生物。
三、 干热灭菌专用生物指示剂
- 标准菌种： 嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）孢子 是干热灭菌最常用的生物指示剂菌种。
- 选择依据： 该菌种孢子对干热具有极强的耐受性，远超过常见污染菌和产品中的内毒素，因此是验证灭菌效果可靠性的理想挑战者。
- 关键特性参数：
- D值： 在特定温度下，使微生物数量减少90%（降低1个对数单位）所需的时间（分钟）。例如，某BI在170℃下的D值可能为1.5分钟。D值是衡量孢子耐热性的核心指标。
- Z值： 使D值变化10倍（1个对数单位）所需的温度变化（℃）。它反映了微生物对温度变化的敏感性。干热灭菌BI的Z值通常较高（如≥20℃）。
- 孢子数量（N₀）： 每支BI所含的活孢子总数，通常≥1.0 x 10⁶。高初始数量确保了挑战的严格性。
- 性能确认： 供应商需提供每批BI的D值、Z值、孢子数量及纯度证明等关键性能数据。
- 载体形式：
- 孢子悬液： 可直接接种到物品表面或最难灭菌位置。
- 孢子条（带载体）： 孢子附着在特定的载体（如滤纸片、金属片、塑料片）上，易于放置和取回。这是最常用的形式。
- 自含式生物指示剂： 将孢子条和装有培养基的小安瓿瓶密封在同一塑料管中。使用后压碎安瓿瓶使培养基与孢子接触，简化培养步骤。
四、 生物指示剂测试流程
- 选择与准备：
- 根据灭菌程序（温度、时间）选择具有适当D值和孢子数量的BI。
- 确认BI在有效期内，包装完好无损。
- 记录BI的批号、有效期、D值、N₀等信息。
- 布点：
- 关键位置： 将BI放置在灭菌设备（如干热灭菌柜）经过验证的冷点（温度最低点）以及灭菌柜腔体的其他代表性位置（如前、中、后、上、中、下）。
- 负载模拟： 测试应在最大负载或最小负载（根据验证要求）下进行，BI应置于负载内部最难灭菌的物品内或表面（如注射剂瓶内部、金属器械缝隙）。
- 对照设置：
- 阳性对照： 取同批号未灭菌的BI进行培养，验证孢子活性及培养基促生长能力（必须100%生长阳性）。
- 阴性对照： 使用未接种的同种培养基培养，验证培养基无菌（必须100%无菌）。
- 灭菌过程：
- 按照既定的灭菌程序（温度、时间）运行设备。
- 确保温度分布均匀性符合要求（通常需连续监控）。
- BI回收与处理：
- 灭菌循环结束后，尽快（避免二次污染）取出BI。
- 若使用带载体的孢子条，需在无菌条件下将其转移至无菌培养液中。
- 若使用自含式BI，直接压碎内部的培养基安瓿瓶。
- 培养：
- 培养条件： 将处理后的BI在推荐的温度下培养。嗜热脂肪地芽孢杆菌通常需要在 55-60℃ 下培养。
- 培养时间： 根据供应商说明书或验证方案确定，通常为24-48小时（或按药典要求，如48小时）。部分方案会延长至7天以检测损伤孢子的延迟生长。
- 培养基： 使用供应商提供的专用培养基或符合药典（如USP, EP）要求的促生长培养基（如大豆酪蛋白消化培养基）。
- 结果判读：
- 阳性指示： 培养基变浑浊（通常伴随pH指示剂颜色变化，如由紫色变黄色），表明有存活孢子生长。
- 阴性指示： 培养基保持澄清（或颜色无变化），表明无存活孢子生长。
- 合格判定标准（示例）： 所有经过灭菌处理的BI培养结果必须为阴性（无生长）。阳性对照必须为阳性（有生长），阴性对照必须为阴性（无生长）。只有满足这些条件，才能判定该次灭菌循环的生物指示剂挑战通过。
五、 应用场景
- 灭菌工艺验证： 首次确认某设备/程序是否能达到无菌保证水平（SAL ≤ 10⁻⁶）。
- 定期再验证： 定期（如每年）或设备发生重大变更（如维修、关键部件更换）后，重新确认灭菌效果。
- 装载方式确认： 验证不同装载模式下（特别是复杂或最大装载）的灭菌效果。
- 日常监控（可选）： 在法规允许或基于风险评估的基础上，可定期使用BI进行监控，作为物理参数监控的补充。但物理参数（温度、时间）是日常监控的基础。
六、 重要考虑因素与注意事项
- D值适用性： BI的D值是在特定温度、特定载体条件下测定的。使用BI进行验证时，必须确保其D值是在与灭菌程序相同或相近的温度下测得，且载体特性不影响热穿透。
- 冷点确认： BI测试结果的有效性高度依赖于BI是否被放置在真实的冷点。这需要通过先前的温度分布研究（空载和满载）来确定。
- 孢子数量： 验证中使用的BI孢子总数 (
N₀) 应足够高，以提供充分的挑战。通常选择N₀ ≥ 10⁶的BI。灭菌后的存活概率 (PNSU) 应 ≤ 10⁻⁶。理论上，灭菌时间应 ≥D值 × (Log₁₀ N₀ + 6)。 - 培养条件： 严格遵守推荐的培养温度和时间至关重要，过低温度或过短时间可能导致受损孢子的复苏失败（假阴性）。延长培养时间有助于检测受损孢子。
- 避免二次污染： 在BI放置、回收和转移过程中，必须严格遵循无菌操作技术，防止环境微生物污染导致假阳性。
- 记录与追溯： 详细记录BI批号、放置位置、灭菌参数、培养条件、观察结果、操作人员等信息，确保全程可追溯。
- 法规符合性： 遵循相关法规和指南要求（如各国GMP、ISO 17665-1、ISO 11138-1/-3、药典等）。
- 供应商资质： 选择信誉良好、符合质量体系要求（如ISO 13485）的供应商，确保BI性能稳定可靠。
- 与物理监控的关系： BI测试是验证和确认灭菌工艺有效性的直接证据，但日常灭菌循环的放行应基于物理参数（温度、时间）的连续监控和记录，这些参数需在验证时被证明能达到所需的微生物灭活效果。
结论：
干热灭菌生物指示剂测试是证明灭菌工艺可靠性的金标准。通过使用高耐受性的标准孢子（如嗜热脂肪地芽孢杆菌），并将其置于灭菌柜冷点及负载内最难灭菌位置，该测试直接挑战灭菌条件是否足以实现所需的微生物杀灭水平（通常SAL ≤ 10⁻⁶）。严谨的方案设计（包括BI选择、布点、对照设置）、规范的操作流程（放置、灭菌、回收、无菌转移、培养）以及准确的结果判读（结合对照），是确保测试结果有效、可信的关键。生物指示剂测试是干热灭菌工艺验证、再验证及关键监控的核心组成部分，为最终产品的无菌保证和患者安全提供了至关重要的科学依据。用户需根据自身工艺特点和法规要求，制定并严格执行生物指示剂测试方案。