压力蒸汽灭菌生物指示剂测试：原理、应用与规范操作
压力蒸汽灭菌是医疗、实验室和工业领域消灭物品上所有微生物（包括最具抵抗力的细菌芽孢）的最可靠方法之一。为确保灭菌过程的有效性，除物理监测（温度、压力、时间）和化学监测（指示剂变色）外，生物指示剂测试是验证灭菌效果是否达到无菌保障水平（SAL）的终极方法，具有不可替代的地位。
一、 生物指示剂的核心作用与重要性
生物指示剂是一种含有已知数量、特定种类、对灭菌方式具有高度抵抗力的微生物（通常为芽孢）的测试系统。其核心价值在于：
- 直接挑战灭菌过程： 它使用公认最难杀灭的微生物（如嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus芽孢）作为挑战菌，直接验证灭菌条件（温度、时间、蒸汽渗透）是否足以杀灭最具抵抗力的微生物。
- 验证灭菌设备性能： 能检测灭菌设备或程序在特定装载、特定周期下的整体效能，发现物理/化学监测可能无法发现的潜在问题（如蒸汽穿透不良、冷空气排除不完全、设备故障）。
- 过程放行的最终依据： 在许多关键应用领域（如植入物灭菌、无菌生产环境），法规要求定期进行生物指示剂测试并确认阴性结果后，才能放行该批次灭菌物品。
- 质量保证的核心环节： 是证明灭菌过程持续符合规范要求（如SAL ≤ 10⁻⁶）的关键证据，是质量管理体系的重要组成部分。
二、 生物指示剂的构成与工作原理
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标准测试菌株：
- 嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus)： 这是国际公认的用于压力蒸汽灭菌验证的标准菌株（如ATCC 7953或等同物）。其芽孢具有极强的耐热性，在121°C的饱和蒸汽条件下，其D值（在特定温度下杀灭90%微生物所需的时间）通常约为1.5 - 3.0分钟。
- 菌量要求： 每支生物指示剂所含的活芽孢数量通常 ≥ 1.0 × 10⁶ CFU（菌落形成单位），以提供足够的挑战强度。
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载体与包装：
- 芽孢通常负载在惰性载体（如滤纸条、不锈钢片、塑料片）上。
- 载体被密封在特定的初级包装内（如玻璃安瓿、塑料管、小袋），既能保护芽孢和载体，又能允许蒸汽充分穿透。
- 初级包装通常置于次级包装（如塑料管、纸袋、自含式外壳）中，便于操作、培养和结果判读。
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自含式生物指示剂：
- 这是目前最常用的类型。它将芽孢载体和装有培养液的玻璃安瓿（或其他容器）整合在一个塑料外壳内。
- 灭菌后，无需打开灭菌器，直接在外壳内压碎或挤破装有培养液的安瓿，使培养液接触载体，即可进行培养。这大大降低了操作污染风险，简化了流程。
- 培养液含有营养物和pH指示剂（如溴甲酚紫），当芽孢复苏生长产酸时，指示剂颜色发生变化（如紫色变黄色）。
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传统生物指示剂：
- 芽孢载体单独包装（如滤纸条在玻璃纸袋中）。
- 灭菌后，需在无菌条件下将载体转移到装有液体培养基（或倾注到琼脂平板）中进行培养。操作要求高，污染风险大，使用比例已显著降低。
三、 生物指示剂测试的标准操作流程
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测试前准备：
- 选择指示剂： 确认生物指示剂适用于压力蒸汽灭菌（121°C或132°C）且未过期。
- 确定位置： 选择最具挑战性的位置放置指示剂。通常建议：
- 灭菌器最难灭菌的部位（通常由设备验证确定，如排水口上方、大型包裹中心、管腔器械内部）。
- 在灭菌物品内（包裹中心、器械管腔）和灭菌器空腔（排气口附近）同时放置。
- 日常监测通常放在最大、最难的灭菌包内。
- 记录信息： 记录灭菌器编号、灭菌程序（如121°C，20分钟）、灭菌日期/时间、生物指示剂批号/有效期、放置位置。
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灭菌过程：
- 将生物指示剂按要求放入预定位置。
- 按照标准操作程序运行灭菌周期。确保物理监测参数（温度、压力、时间）符合要求。
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灭菌后处理：
- 灭菌周期结束，物品冷却后，小心取出生物指示剂。
- 检查生物指示剂包装是否完好，载体是否明显受损（如有破损可能污染，结果无效）。
- 让生物指示剂冷却至室温（避免高温影响后续培养）。
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培养与激活（自含式）：
- 按照说明书要求（通常是用力按压或挤压塑料外壳），压碎内部的培养液安瓿，使培养液完全浸没芽孢载体。
- 确保培养液与载体充分接触。
- 将激活后的生物指示剂放入专用的恒温培养设备中。
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培养条件：
- 温度： 56°C ± 2°C。这是嗜热脂肪地芽孢杆菌的最适生长温度。
- 时间： 标准培养时间为48小时。一些快速生物指示剂可能缩短至3-6小时，但最终结果仍需在48小时后确认。
- 对照： 每次测试必须同时培养一支未经灭菌的同批次生物指示剂作为阳性对照（证明芽孢存活和培养条件有效），以及一支只含培养基的阴性对照（证明培养基无菌）。阳性对照必须显示生长（颜色变化），阴性对照必须无变化。
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结果判读：
- 阳性结果（灭菌失败）： 培养液颜色由紫色变为黄色（或根据指示剂说明），表示有活芽孢存活并生长，灭菌过程未能杀灭所有测试芽孢。
- 阴性结果（灭菌通过）： 培养液颜色保持紫色（或未变化），表示无活芽孢存活，灭菌过程有效杀灭了所有测试芽孢。
- 阳性对照： 必须显示阳性（颜色变化），否则本次所有测试结果无效。
- 阴性对照： 必须保持阴性（颜色不变），否则本次所有测试结果无效。
四、 结果分析与应对措施
- 阴性结果： 结合物理和化学监测结果合格，可认为该次灭菌过程有效。
- 阳性结果（或阳性对照失败/阴性对照阳性）：
- 立即行动： 立即停止使用该灭菌器进行灭菌操作。隔离并召回自上次生物指示剂测试合格以来所有经该灭菌器处理的物品。
- 初步调查： 检查生物指示剂是否过期、受损？培养温度是否正确？操作过程是否有误？物理/化学监测结果是否正常？
- 深入调查： 通知设备维护人员检查灭菌器（如蒸汽质量、真空度、密封性、传感器校准等）。检查灭菌程序、装载方式、包装材料等。
- 纠正措施： 根据调查结果修复设备、调整程序、重新培训人员等。
- 重新验证： 在采取纠正措施后，必须使用生物指示剂进行空载和满载测试（通常连续3次），确认合格后才能重新启用灭菌器。
- 受影响物品处理： 召回物品需视为非无菌，根据情况选择重新灭菌（若物品允许且能保证安全）或废弃处理。重新灭菌必须使用确认合格的灭菌器和程序，并再次进行生物指示剂测试。
- 记录与报告： 详细记录所有阳性结果、调查过程、发现的原因、采取的纠正措施和重新验证结果，并按要求上报相关部门。
五、 关键注意事项
- 遵循规范： 严格遵循设备操作手册、灭菌程序要求、生物指示剂产品说明书以及相关的国家/国际标准（如ISO 11138系列、ISO 17665、GB 18281等）。
- 定期测试： 建立明确的生物指示剂测试频率，至少包括：
- 设备验证： 新设备启用、大修后、重新安置后。
- 常规监测： 通常每周一次（高风险植入物应每锅次进行），频率应根据风险评估确定。
- 灭菌物品验证： 新型包装材料、新装载方式、新灭菌程序首次使用前。
- 位置挑战性： 确保生物指示剂放置在经确认的最难灭菌位置。
- 储存与管理：
- 按照说明书要求储存（通常2-25°C避光干燥）。
- 严格管理有效期，过期必须丢弃。
- 避免剧烈震动、高温、化学污染。
- 质量控制： 每次测试必须包含有效的阳性对照和阴性对照。
- 人员培训： 操作人员必须接受专业培训，理解原理和重要性，熟练掌握操作、培养和结果判读方法。
- 记录完整： 详细记录测试日期、时间、灭菌器、程序、生物指示剂信息（批号、有效期）、放置位置、培养起止时间、培养温度、所有结果（测试、阳性对照、阴性对照）、操作者签名等。记录应可追溯、易检索、长期保存。
- 综合监测： 生物指示剂测试是验证手段之一，绝不能替代物理监测和化学监测！ 必须三者结合使用：
- 物理监测： 实时监控每个灭菌周期的关键参数（温度、压力、时间）。
- 化学监测： 用于每个灭菌包内和包外（如指示胶带、标签、包内指示卡），指示是否暴露于灭菌过程。
- 生物监测： 定期验证整个灭菌过程（设备、程序、装载）的有效性。
结论
压力蒸汽灭菌生物指示剂测试是确保灭菌过程达到无菌保障水平的科学基石。它通过挑战最难杀灭的标准微生物芽孢，提供灭菌效果最直接、最可靠的证据。规范、严谨地执行生物指示剂测试程序，结合完善的物理监测和化学监测体系，并严格管理储存、操作、培养和记录，是保障灭菌物品安全、保护患者和使用者健康、满足法规要求的不可或缺的核心环节。深刻理解其原理、价值与操作规范，并将其作为灭菌质量保证体系的重中之重，是所有相关从业者的基本职责。