L5178Y细胞基因突变试验 - 中析研究所生物检测中心

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L5178Y 小鼠淋巴瘤细胞基因突变试验：原理与应用

1. 引言

L5178Y小鼠淋巴瘤细胞基因突变试验（简称MLA）是一种广泛应用于遗传毒理学研究的体外检测系统。该试验通过检测位于常染色体上的胸苷激酶（Tk）基因位点的突变，评估化学物质或物理因素诱导基因突变的能力，为遗传毒性风险评估提供关键数据。

2. 试验原理

2.1 细胞模型

L5178Y细胞源自小鼠淋巴瘤，为悬浮生长的成淋巴细胞系。
关键特性：细胞系为Tk基因杂合子（Tk⁺/⁻），保留正常Tk功能，但可通过突变失活。

2.2 突变筛选机制

正常状态：细胞可利用胸苷（dThd）通过胸苷激酶（TK）合成DNA。
突变事件：受试物诱导Tk基因失活（包括点突变、缺失、染色体畸变），导致TK酶功能丧失。
选择性培养：
- 使用含三氟胸苷（TFT）的培养基：TK⁺细胞因摄入TFT死亡，而Tk⁻突变细胞因无法代谢TFT存活。
- 突变集落可通过显微镜计数或自动化设备定量。

3. 试验流程（OECD 490 标准方法）

3.1 细胞准备

使用规范传代的细胞库（如TK6亚系），定期检测自发突变率（通常<100×10⁻⁶）。
培养基：含10%马血清的RPMI 1640，补充必需氨基酸（含次黄嘌呤及胸苷）。

3.2 染毒处理

暴露期：对数生长期细胞暴露于受试物（3-6个浓度梯度）及溶剂对照，持续3-6小时（±代谢活化系统S9）；
表达期：染毒后洗涤细胞，在非选择性培养基中培养2-3天（确保突变表型表达）；
克隆形成：将细胞接种于含TFT（3-5 μg/mL）的96孔板（2000细胞/孔）及无TFT板（1细胞/孔）测定存活率；
培养：37℃、5% CO₂培养10-14天。

3.3 数据分析

**突变频率（MF）**计算：
$MF = \frac{\text{突变集落数}}{\text{接种细胞数} \times \text{存活率}}$
判定标准：
- 阳性：剂量依赖性MF增加（≥2倍溶剂对照）且具有统计学意义（p<0.01）；
- 阴性：最高浓度下细胞存活率≥10%，且无显著MF升高。

4. 方法学特点

优势

可检测多种遗传损伤（点突变、大片段缺失、染色体重组）；
高灵敏度（因Tk位点杂合性）；
符合国际指南（OECD 490, ICH S2R1）。

局限性

需严格控制培养条件（pH、血清批次）；
大集落（小突变）与小集落（大片段损伤）的生物学意义需结合分析。

5. 质量控制

背景数据监控：
- 自发突变率：80–140×10⁻⁶（-S9）；100–200×10⁻⁺⁶（+S9）；
- 存活率：溶剂对照组 ≥70%。
阳性对照：
- 无S9：甲基磺酸乙酯（EMS，10-25 μg/mL）；
- 有S9：环磷酰胺（CP，1-5 μg/mL）。

6. 应用领域

化学品注册（REACH, 农药登记）；
药物安全评价（ICH 遗传毒性标准组合）；
环境污染物筛查（水、大气颗粒物提取物）。

7. 结论

L5178Y细胞Tk基因突变试验是遗传毒性测试体系的核心方法之一，其高通量、高灵敏度的特性为识别潜在致突变物提供可靠依据。标准化操作与严格质控是确保数据有效性的关键，其结果需结合其他遗传终点综合分析。

参考文献
OECD (2016). Test No. 490: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test Using the Thymidine Kinase Gene. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals.
ICH (2011). S2(R1) Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.

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