一次破损皮肤刺激试验 - 中析研究所生物检测中心

破损皮肤刺激试验的科学方法与评价体系研究

摘要： 破损皮肤刺激试验是评估化学物质、医疗器械或制剂成分接触受损皮肤后潜在局部刺激或腐蚀作用的关键方法。本试验严格遵循国际公认的实验室操作规范（如OECD TG 404），以科学、客观地衡量受试物在模拟人体皮肤屏障受损状态下的安全性特征。本文详细介绍试验的设计原理、标准化操作流程、严谨的观察指标评价体系及结果阐释要点，为皮肤安全性评估提供科学依据。

一、试验目的与原理

核心目标： 评价受试物单次接触破损皮肤后，诱发局部皮肤产生可逆性炎症（刺激）或不可逆性组织损伤（腐蚀）的潜在能力。
科学基础： 健康皮肤具有卓越的保护屏障作用。当皮肤屏障因物理、化学因素受损（如擦伤、切割、疾病），其对外源性物质的通透性显著增加，潜在的刺激性或腐蚀性物质更容易渗透进入活组织层，引发局部毒性反应。本试验通过在实验动物（常用新西兰白兔）背部皮肤人为制造标准化、微小的表皮损伤，模拟人体常见的皮肤破损状态，进而评估受试物在此条件下的局部效应。

二、试验材料与动物准备

受试物： 明确标识（不涉及企业信息），物理形态（液态、固态、膏状、粉末等）及所需试验浓度。固态/膏状物可直接测试，液体通常直接使用或按规定溶剂配制。
试验动物：
- 种类： 首选健康的成年新西兰白兔。
- 数量： 通常至少3只，需满足统计学要求。
- 饲养： SPF级动物房单笼饲养，提供标准饲料、饮水，适应环境至少5天后使用。试验前24小时背部剃毛（面积约10cm x 15cm）。
仪器材料：
- 无菌器械（剪刀、镊子）
- 皮肤记号笔
- 无菌敷料/透气胶带
- 电子秤
- 数码相机（记录反应）
- 个人防护装备（实验服、手套、口罩等）
- 标准的皮肤刺激反应评分表

三、试验操作流程

破损皮肤制备： 麻醉动物后，在每只动物剃毛区域内，选取健康的测试部位。使用经消毒的器具（如精细手术刀片或专用表皮剥离器械），在选定的部位制造表皮屏障损伤：
- 确保损伤程度： 仅去除表皮角质层和部分颗粒层，露出真皮层但不引发出血（轻微渗液是可接受的）。损伤呈平行排列（通常4处），间距足够。此步骤需由经验丰富的人员操作。
受试物施加：
- 将适量受试物（固体约0.5g，液体约0.5ml）均匀涂敷于一处制备好的破损皮肤上。
- 同时设定阳性对照（如已知刺激物）和阴性对照（生理盐水或溶剂对照）区域。
- 用一层无菌、惰性、透气性敷料覆盖所有处理区域，再用无刺激性胶带固定，必要时可使用束缚装置（确保动物舒适）防止动物舔舐或蹭掉敷料。
- 接触时间： 通常为4小时。
敷料移除与清洁：
- 接触时间结束后，小心移除敷料和束缚装置。
- 使用温水或生理盐水轻柔冲洗处理部位，清除残留受试物。轻柔拍干。

四、观察与评价指标

观察时间点： 在移除敷料并清洁后即刻（0小时），以及之后的24、48和72小时进行系统观察评价皮肤反应。必要时可延长至7或14天（尤其在观察到持续性反应或可疑腐蚀时），直至反应完全消失或稳定。
观察内容（针对每个处理部位）：
- 红斑（发红）： 毛细血管扩张充血程度。
- 水肿（肿胀）： 组织液积聚导致的肿胀程度。
- 其他异常： 出血、焦痂形成、皮肤坏死、分泌物增多等腐蚀迹象。
评分标准（Draize计分法）：
- 红斑与焦痂形成：
  - 无红斑：0分
  - 轻微红斑（勉强可见）：1分
  - 明显红斑：2分
  - 中度至重度红斑：3分
  - 严重红斑（紫红色）至轻微焦痂形成（深层损伤）：4分
- 水肿形成：
  - 无水肿：0分
  - 轻微水肿（勉强可见）：1分
  - 轻度水肿（明显隆起，轮廓清晰）：2分
  - 中度水肿（隆起约1mm）：3分
  - 重度水肿（隆起超过1mm，面积超出处理区）：4分
- 腐蚀/溃疡/深层损伤： 出现此类不可逆损伤通常直接判定具有强刺激性或腐蚀性，评分极高且需特别记录描述其性质（如坏死深度、范围、分泌物）。
记录： 详细记录每个时间点每只动物每个处理部位的红斑、水肿评分及其他观察到的任何皮肤异常现象（如裂纹、脱屑、结痂、出血）。使用数码相机拍照存档（清晰标注动物编号、处理组、时间点）。

五、结果计算与解读

个体平均刺激评分： 计算每只动物在每一个观察时间点，所有受试物处理部位的红斑评分总和与水肿评分总和（分别计算），再除以处理部位数得到该动物该时间点的平均红斑评分和平均水肿评分。
时间点平均刺激评分： 计算所有试验动物在同一观察时间点平均红斑评分的算术平均值及平均水肿评分的算术平均值。
原发性刺激指数（P.I.I.）： 计算每个动物在24、48和72小时三个观察时间点的平均红斑评分与平均水肿评分之和的总和，再除以观察次数（通常为3）。最后计算所有动物P.I.I.的算术平均值。
结果判定：
- 无刺激性： P.I.I. ≤ 0.4（且各时间点评分低，无可逆损伤）。
- 轻度刺激性： 0.5 ≤ P.I.I. ≤ 1.9（刺激反应轻微且短暂）。
- 中度刺激性： 2.0 ≤ P.I.I. ≤ 4.9（刺激反应明显，可能出现可逆性表层损伤）。
- 强刺激性： P.I.I. ≥ 5.0（反应严重，可能伴有炎症渗出、皮肤局部坏死等）。若观察到明显的皮肤坏死、焦痂形成或溃疡等不可逆的组织破坏，无论P.I.I.多少，应判定该物质在本试验条件下具有腐蚀性。
- 阴性/溶剂对照组与阳性对照组反应必须符合预期，以佐证试验系统的有效性。

六、试验报告核心内容

摘要： 简述试验目的、方法、受试物、关键结果（P.I.I.值及最终刺激性分级）。
引言： 试验背景、依据标准（如OECD TG 404）。
材料与方法：
- 受试物描述（非企业信息）。
- 实验动物（种属、品系、来源、数量、体重范围、性别、饲养条件）。
- 详细试验步骤（皮肤准备、破损方法描述、受试物施加剂量/体积、敷料、接触时间、清洁方法）。
- 观察方案（时间点、指标、评分标准）。
- 数据处理与统计方法。
结果：
- 详细列出每只动物每个观察时间点各处理部位的红斑、水肿评分及其他观察记录。
- 列出各时间点的平均刺激评分。
- 计算并报告原发性刺激指数（P.I.I.）及其平均值。
- 附代表性照片（清晰标注）。
讨论： 分析结果，解释刺激性程度判定的依据，讨论反应的动态变化过程（如反应高峰时间、消退情况），说明阳性对照和阴性对照结果是否支持试验有效性。
结论： 明确给出受试物在本次破损皮肤刺激试验条件下的最终刺激性评价结论（如：在此破损皮肤刺激试验中，受试物表现为XX刺激性物质）。
声明： 清晰说明试验符合实验室质量管理规范及动物伦理福利要求（如适用）。

七、伦理考量与替代方法

动物福利核心原则（3R）： 实验设计严格遵守“减少（Reduction）、优化（Refinement）、替代（Replacement）”原则。优化动物舒适度（如麻醉、无痛损伤技术、减轻束缚压力）。仅在科学上必需且无成熟可靠的体外替代方法时进行动物实验。
体外替代方法探索： 积极关注并验证如重组人表皮模型（RhE）测试皮肤腐蚀/刺激性等替代方法的研究进展与应用有效性。
伦理审查： 试验方案必须提交并获得独立的实验动物伦理委员会审批。