多次完整皮肤刺激试验：评估化学物质皮肤刺激潜能的标准化方法
一、引言
多次完整皮肤刺激试验是一种重要的实验室毒理学试验方法，旨在评估局部反复接触化学物质（如化妆品原料、工业化学品、药品辅料等）对完整健康皮肤产生的潜在刺激或腐蚀作用。相较于单次刺激试验，它更贴近于人类在日常生活或工作中可能遇到的重复暴露场景，对于评价产品的长期使用安全性具有更实际的意义。该试验遵循国际公认的标准指南（如经济合作与发展组织OECD Test Guideline 404），以确保结果的科学性、可靠性和可比性。
二、试验目的
- 识别皮肤刺激/腐蚀性： 确定受试物在多次涂抹后，是否具有引起实验动物皮肤可逆性炎症（刺激）或不可逆性组织损伤（腐蚀）的潜在能力。
- 评估刺激强度： 量化刺激反应的严重程度，为产品安全风险评估提供依据。
- 支持安全评价： 为化学品分类、标签和安全使用说明提供关键数据，是产品注册和上市的重要安全性资料组成部分。
三、试验原则
试验通常在健康的成年实验动物（通常选用新西兰白兔或其它适宜的品系）的完整皮肤上进行。将受试物以固定剂量，在固定时间间隔内（通常每天一次），反复涂抹或敷用于动物背部预先脱毛的皮肤区域（通常选择多个位点进行平行或自身对照）。在规定的暴露期后，移除受试物，并在后续的观察期内（通常持续数天至数周），系统地观察、记录涂抹部位皮肤出现的红斑、水肿等反应，并根据标准化的评分系统对刺激程度进行量化评估。
四、试验程序概要
- 受试物准备： 根据受试物的物理形态（液体、固体、糊状物等）和预期使用方式，确定合适的试验浓度、剂量（通常为0.5ml或0.5g）和赋形剂（如无刺激性的水、凡士林等）。设置赋形剂对照组和/或已知刺激性的阳性对照组。
- 实验动物：
- 种类： 首选健康成年新西兰白兔。有时也使用豚鼠或其他认可种属。
- 数量： 每组通常需要3只或以上的有效动物。若使用自身对照设计（同一动物不同部位），动物数量可适当减少。
- 饲养： 动物需在符合动物福利标准的设施中单笼饲养，提供适宜的环境（温度、湿度、光照周期）、充足的食物和水。试验前需有适应期。
- 皮肤准备： 在试验开始前约24小时，轻柔剃除动物背部两侧脊柱两侧的毛发，避免损伤皮肤。
- 剂量设置与分组：
- 通常设置多个剂量组（包括预期使用浓度、高浓度）和必要的对照组（阴性对照-赋形剂，阳性对照-已知刺激物）。
- 采用随机分组原则。
- 受试物施用：
- 将受试物均匀涂抹或覆盖于约6平方厘米的完整皮肤区域。
- 使用半封闭或封闭性敷料（如纱布、无刺激性胶带）覆盖固定，防止动物舔舐或擦掉受试物。
- 暴露频率与周期： 典型方案为每天一次（±1小时），连续涂抹14天（或根据特定要求调整，如7天、21天等）。
- 暴露时间： 每次通常为4-6小时（或根据产品特性和指南要求调整）。
- 观察与评分：
- 时间点： 在每次涂抹前（约移除敷料后1小时）以及末次涂抹后24、48、72小时（或更长观察期）进行皮肤反应观察和评分。移除敷料后立即进行初步观察也很重要。
- 观察指标： 主要观察涂抹部位的红斑和水肿情况。
- 评分系统： 采用国际公认的标准评分系统（通常基于Draize评分或其修订版）：
- 红斑和焦痂形成： 0分（无红斑）至4分（严重红斑至轻微焦痂形成）。
- 水肿： 0分（无水肿）至4分（严重水肿，隆起超过1mm）。
- 其他观察： 同时记录是否存在脱屑、皲裂、溃疡、坏死、色素沉着等任何其他皮肤反应，以及动物的全身状况（体重、行为、死亡等）。
- 结果计算：
- 计算每只动物在每个观察时间点的原发性刺激指数：该时间点所有涂抹部位的红斑和水肿总分之和。
- 计算每组动物在各个观察时间点的平均原发性刺激指数。
- 通常关注最高平均刺激指数（整个观察期内最高的平均值）以及刺激反应的持续性（反应消退所需时间）。
五、结果解释与评价
- 刺激强度分级： 根据最高平均刺激指数，结合反应的持续时间和性质（是否可逆），可对受试物的皮肤刺激潜力进行分级（例如：无刺激、轻度刺激、中度刺激、重度刺激）。具体的分级标准需参照所依据的试验指南（如OECD TG 404）或相关法规要求。
- 腐蚀性判断： 如果在观察期内，皮肤出现坏死、焦痂、脱色等不可逆的组织损伤，或刺激反应（如严重红斑/水肿）在停止接触后14天内仍未完全恢复，通常认为该物质具有腐蚀性。
- 综合分析： 需结合对照组结果、动物个体差异、反应模式（如是否进行性加重）、组织病理学检查结果（如果进行）等综合判断受试物的潜在危害。
六、试验局限性
- 物种差异： 动物皮肤在结构和功能上与人类皮肤存在差异（如角质层厚度、毛囊密度、汗腺分布），可能导致对刺激物的敏感性不同。
- 封闭条件： 试验采用封闭式敷贴，可能增强某些物质的渗透和刺激作用，不完全等同于人类实际使用条件（如衣物覆盖下的半封闭状态）。
- 主观评分： 红斑和水肿的评分存在一定的主观性，需由经验丰富的技术人员操作以减小误差。
- 外推至人类： 动物试验结果需谨慎外推至人类，通常用于初步筛选和危害识别，最终人类风险评估还需结合其他数据（如体外试验、人体斑贴试验等）。
七、动物福利与替代方法
- 3R原则： 本试验涉及动物使用，必须严格遵循“减少（Reduction）、优化（Refinement）、替代（Replacement）”的3R原则。优化措施包括：使用最少动物数量、选择合适种属、确保熟练操作技术以减轻动物痛苦、提供完善的镇痛和护理、及时终止严重痛苦的动物试验等。
- 替代方法： 随着科技发展，基于重建人体表皮模型（如EpiDerm™, EpiSkin™, SkinEthic™ RHE）的体外皮肤刺激/腐蚀试验（如OECD TG 439, 431）已被广泛接受，可用于完全替代动物试验进行化学品腐蚀性和严重刺激性的分类。对于非严重刺激性的评估，体外方法仍在发展和验证中。法规机构通常鼓励优先使用经过验证的体外替代方法。
八、结论
多次完整皮肤刺激试验是评估化学物质反复接触后皮肤刺激和腐蚀潜力的关键标准化方法。它为保障消费者和职业暴露人群的健康安全提供了重要的科学依据。试验需严格按照国际公认的指南规范操作，确保数据的质量和可靠性。同时，随着科学进步和对动物福利的关注，积极发展和应用经过验证的体外替代方法以减少乃至取代动物试验，是未来的重要发展方向。试验结果需在充分理解其局限性的基础上，结合其他相关信息进行综合风险评估。