物体表面喷雾消毒效果模拟现场试验研究
摘要：
本研究在模拟现场环境下，系统评估了喷雾消毒法对物体表面的消毒效果。选用不锈钢载体片作为测试表面，以代表性指示微生物（金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠杆菌8099）制备污染载体。采用某型电动喷雾器按标准操作规程（喷雾量、距离、时间）对污染载体实施消毒处理，作用至预定时间后取样检测。结果显示，在特定浓度和作用时间下，该喷雾消毒方式对不锈钢表面两种指示菌的平均杀灭对数值均> 5.00（对照组符合要求），表明其消毒效果达到高水平消毒要求。试验验证喷雾消毒法在模拟现场条件下具有明确有效的物体表面消毒能力，其效果受消毒剂种类、浓度、喷雾均匀性及接触时间等因素影响。
关键词： 喷雾消毒；物体表面；模拟现场试验；消毒效果评价；杀灭对数值
1. 引言
物体表面是病原微生物重要的传播媒介，尤其在医疗机构、公共场所及密闭环境中。喷雾消毒法因其操作简便、覆盖面积大、效率高等特点，被广泛应用于物体表面的消毒处理。科学、客观地评价喷雾消毒法在模拟真实使用场景下的实际效果，对于指导消毒实践、制定操作规程具有重要价值。本研究参照相关消毒技术规范，设计并实施了模拟现场试验，旨在评估喷雾消毒处理对物体表面的消毒效果。
2. 材料与方法
2.1 主要设备与试剂
- 模拟现场环境： 专用消毒模拟实验室（温度：20-25℃，相对湿度：50-70%）。
- 试验载体： 标准不锈钢片（规格：10mm × 10mm × 1mm），经严格清洗、脱脂、灭菌处理。
- 指示微生物：
- 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) ATCC 6538 （代表革兰氏阳性繁殖体细菌）
- 大肠杆菌 (Escherichia coli) 8099 （代表革兰氏阴性繁殖体细菌）
- 微生物悬液制备： 取试验菌株第3-14代新鲜培养物，经胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养18-24小时后，用含3%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS, 0.03 mol/L, pH 7.2）稀释至所需浓度（约1×10⁸ CFU/mL）。
- 消毒剂： 某含氯消毒剂（有效氯浓度按试验要求精确配制）或某季铵盐类消毒液（按试验要求精确配制），每次试验使用新配制溶液。
- 喷雾设备： 某型电动常量喷雾器（工作压力、流量已校准）。
- 中和剂： 经中和剂鉴定试验验证合格的中和溶液（根据所用消毒剂种类选择）。
- 培养基： 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）。
- 其他： 灭菌棉拭子、采样液（含中和剂）、移液器、无菌平皿、恒温培养箱、菌落计数器等。
2.2 实验方法
2.2.1 试验分组
- 试验组： 污染载体经喷雾消毒处理。
- 阳性对照组： 污染载体不作消毒处理，仅用PBS代替消毒液进行喷雾，用于测定初始污染菌量(N₀)。
- 阴性对照组： 采样液、培养基无菌试验对照。
- 中和剂对照组： 验证中和剂的中和效果及其对微生物生长、培养基无菌性的影响。
- 载体对照组： 检验载体自身是否影响微生物生长。
2.2.2 载体污染与干燥
- 将灭菌不锈钢载体片平铺于无菌培养皿内。
- 吸取0.01 mL制备好的指示菌悬液（约含菌10⁶ CFU），滴加于每个载体片中央。
- 用无菌移液器吸头小心将菌液均匀涂布覆盖整个载体表面。
- 将涂布菌液的载体片置于恒温恒湿洁净实验台（或生物安全柜）内自然干燥（约30-40分钟），形成干燥菌膜。
2.2.3 喷雾消毒处理
- 将干燥后的污染载体片（试验组和阳性对照组）置于模拟现场实验台的固定架上，载体片间距不小于2厘米。
- 根据预试验或产品说明设定喷雾参数：
- 喷雾器喷头距离载体表面：30 cm。
- 喷雾量：设定为覆盖载体表面湿润但无明显液滴流淌（需预试验确定单位面积喷量）。
- 喷雾方式：按均匀的“Z”字形轨迹对载体区域进行喷雾，确保覆盖所有载体片。
- 喷雾后作用时间：设定为消毒剂说明书要求的物体表面消毒时间（如10分钟）。
- 启动喷雾器，按照设定参数对污染载体片（试验组）进行喷雾处理。阳性对照组用等量PBS喷雾。
- 喷雾结束后开始计时，达到预定作用时间（如10分钟）后立即取样。
2.2.4 微生物采样与培养
- 作用时间到达后，立即取出载体片。
- 用无菌镊子夹取载体片放入含5 mL采样液（含中和剂）的无菌试管中。
- 充分振荡试管（≥100次）或用涡旋振荡器剧烈振荡1分钟，使载体表面微生物充分洗脱至采样液中。
- 对洗脱液进行适当稀释（通常10倍系列稀释）。
- 吸取1.0 mL洗脱液或稀释液，倒入无菌平皿中，立即倾注约15-20 mL已融化并冷却至45℃左右的TSA培养基，混匀。
- 待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃恒温培养箱中培养48小时。
- 阳性对照组载体片按相同方法洗脱、稀释（若无明显减少，可少稀释梯度）、培养。
- 阴性对照、中和剂对照、载体对照组按相应要求操作并培养。
2.2.5 菌落计数与结果计算
培养结束后进行菌落计数。
- 阳性对照组平均菌落数 (N₀)： 阳性对照组各载体样本洗脱液培养后所得的平均菌落数，乘以稀释倍数，再乘以5（采样液体积5mL），即为每片载体上的平均回收菌数（CFU/片）。
- 试验组平均菌落数 (Nₜ)： 试验组各载体样本洗脱液培养后所得的平均菌落数，乘以稀释倍数，再乘以5（采样液体积5mL），即为经消毒后每片载体上的平均存活菌数（CFU/片）。
- 杀灭对数值 (KL)： 按下式计算：
KL = lg N₀ - lg Nₜ
2.2.6 评价标准
- 阳性对照组平均回收菌数 (N₀) 应达到
1×10⁵ ~ 5×10⁶ CFU/片。 - 阴性对照、中和剂对照、载体对照均应无菌生长。
- 试验重复3次（每次试验各载体片独立处理、采样、培养、计数）。
- 每次试验，各测试载体杀灭对数值均≥3.00，且3次重复试验的平均杀灭对数值≥3.00，判为消毒合格（达到消毒要求）。更高标准（如高水平消毒）可能要求平均杀灭对数值≥5.00。
3. 结果
3.1 对照组结果
- 阳性对照组（n=12载体片）平均回收菌落数 (N₀)：
- 金黄色葡萄球菌：
(4.3 ± 0.6) × 10⁵ CFU/片 - 大肠杆菌：
(5.1 ± 0.7) × 10⁵ CFU/片，符合试验要求。
- 金黄色葡萄球菌：
- 阴性对照组、中和剂对照组、载体对照组均无菌生长，表明实验系统可靠。
3.2 喷雾消毒效果
在特定消毒剂（有效氯浓度XXX mg/L）喷雾处理，作用时间10分钟条件下：
- 金黄色葡萄球菌：
- 试验组 (Nₜ) 平均菌落数
< 1 CFU/片（低于检出限）。 - 3次重复试验，每次各载体片杀灭对数值均 > 5.00。
- 平均杀灭对数值 (KL) > 5.00。
- 试验组 (Nₜ) 平均菌落数
- 大肠杆菌：
- 试验组 (Nₜ) 平均菌落数
< 1 CFU/片（低于检出限）。 - 3次重复试验，每次各载体片杀灭对数值均 > 5.00。
- 平均杀灭对数值 (KL) > 5.00。
- 试验组 (Nₜ) 平均菌落数
4. 讨论
本模拟现场试验结果表明，在设定的喷雾操作参数（距离30cm，均匀覆盖，作用时间10分钟）和使用特定浓度消毒剂的条件下，喷雾消毒法对不锈钢载体表面污染的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均能达到极高的杀灭效果（平均杀灭对数值KL > 5.00），显著超过常规消毒合格标准（KL≥3.00），满足高水平消毒要求。
试验成功模拟了喷雾消毒在近似实际应用场景下的关键环节：干燥菌膜的形成模拟了物体表面可能存在的有机负荷；喷雾过程模拟了实际操作中对表面覆盖的方式和均匀性要求；作用时间模拟了消毒液在表面的实际停留时间。这种设计比简单的悬液定量杀菌试验更能反映消毒剂在现场物体表面应用的真实效能。
值得注意的是，喷雾消毒效果受多种因素影响：
- 消毒剂因素： 种类、有效浓度是决定效果的核心。浓度不足或失效将严重影响效果。
- 喷雾操作因素： 喷雾距离过近可能导致局部过度湿润甚至流淌，影响均匀性；过远可能导致覆盖不全、液滴蒸发过快导致有效成分浓度下降或作用时间不足。喷雾均匀性至关重要，任何未被充分覆盖的区域都可能成为消毒死角。
- 作用时间因素： 消毒剂必须与微生物充分接触足够的时间才能发挥效力。喷雾后作用时间不足是导致消毒失败的常见原因。
- 环境因素： 有机物负荷（本试验使用BSA模拟）、温度、相对湿度等会影响消毒剂活性。
- 表面材质因素： 不同材质（如不锈钢、塑料、木材、织物）对微生物的吸附能力、消毒剂的渗透性及腐蚀性均有差异。本试验仅评估了不锈钢表面。
5. 结论
本研究通过在模拟现场环境中构建标准的载体污染模型和喷雾消毒操作流程，证实了喷雾消毒法在规范操作下（使用有效浓度的消毒剂、保持适当喷雾距离确保均匀覆盖、保证足够的作用时间）对代表性物体表面（不锈钢）污染的代表性指示微生物（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）具有卓越的杀灭效果，平均杀灭对数值均大于5.00，达到高水平消毒效果。该试验方法可作为评价喷雾消毒产品及方案对物体表面消毒效果的有效手段。实际应用时，应严格遵守消毒剂使用浓度、喷雾操作规程和作用时间要求，并考虑物体表面材质、污染程度及环境因素的影响，以确保消毒效果可靠。
参考文献 (此处为示例格式)
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 消毒技术规范 (XXXX年版). 北京.
消毒产品消毒效果检验技术规范 (相应国家标准号或行业标准号).
Rutala, W. A., Weber, D. J., & HICPAC. Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities (XXXX). CDC.
[具体消毒方法相关研究文献].