内镜消毒模拟现场试验

内镜消毒模拟现场试验：方法与质量控制要点

内镜作为侵入性诊疗工具，其复用过程中的消毒灭菌效果直接关乎患者安全。为严格评估高水平消毒方法的可靠性与重现性，模拟现场试验（Simulated Use Testing）成为验证环节的关键步骤。该试验通过模拟临床最不利条件，综合评估消毒流程对人工污染病原体的杀灭能力。

一、 试验目的与依据
本试验旨在依据国家《软式内镜清洗消毒技术规范》（以下简称“规范”）及国际相关标准要求，在可控实验条件下，模拟内镜临床使用后污染状态，评估特定高水平消毒程序（包括清洗、消毒、漂洗等全过程）对病原微生物的杀灭效果，确认其能否达到规定的消毒合格要求（如对试验菌杀灭对数值≥3.00 lg）。

二、 试验核心要素

1. 代表性试验菌株：

   • 铜绿假单胞菌： 选择标准菌株（如ATCC 15442），因其对消毒剂耐受性较强，生物膜形成能力强，是内镜相关感染常见病原体。
   • 龟分枝杆菌脓肿亚种： 选择标准菌株（如ATCC 19977），作为消毒剂挑战性最强的指示菌之一，尤其用于评价对分枝杆菌的杀灭效果。
   • 试验菌悬液制备： 菌株需经复苏、传代培养至稳定期，采用适宜稀释液（如含有机干扰物的磷酸盐缓冲液PBS）制备成高浓度菌悬液（通常≥10⁹ CFU/mL），确保活力。

2. 模拟污染载体：

   • 材质选择： 首选与内镜真实管道材质（如聚四氟乙烯PTFE）相同或具有相似表面特性的材料。
   • 载体形态： 通常为管状或片状载体。
   • 关键处理： 载体需彻底清洗灭菌（如高压蒸汽灭菌或浸泡于高水平消毒剂中足够时间后充分冲洗），确保无任何残留消毒剂或抑制剂。灭菌后需验证无菌性。

3. 人工污染与生物膜模拟：

   • 污染方法：
     • 载体浸泡法： 将灭菌载体完全浸没于高浓度试验菌悬液中，在适宜温度（如室温或37℃）下浸泡一定时间（至少30分钟，可延长至数小时或过夜）。
     • 载体腔内灌注法 (更贴近实际)： 对于管状载体，可使用注射器将菌悬液缓慢、均匀地注入并充满管腔，确保内壁完全接触菌液，排出气泡，封堵两端后在适宜条件下静置污染。
   • 生物膜模拟（增强挑战性）： 为更真实模拟临床难以清除的污染状态，可将污染后的载体转移至新鲜培养基（如胰蛋白酶大豆肉汤TSB）中，在适宜条件下（如37℃）孵育一定时间（如24-48小时），促进试验菌在载体表面形成生物膜。
   • 阳性对照载体： 污染处理后，需取部分载体作为阳性对照，不经消毒处理，直接进行洗脱和菌落计数，验证初始污染量（通常要求≥1×10⁶ CFU/载体）。

4. 模拟现场消毒处理：

   • 预处理（模拟床侧处理）： 载体从污染状态取出后，模拟临床操作，立即用含多酶清洗剂的溶液进行浸泡或灌注冲洗（通常≥1分钟），去除大部分可见有机物和部分微生物。
   • 清洗： 严格按照待验证消毒流程中规定的清洗程序进行。包括但不限于：
     • 在多酶清洗液中浸泡、刷洗（对管腔使用专用刷）、冲洗（使用压力水枪和气枪交替冲洗管腔）。
     • 清洗水质应使用符合规范要求的纯化水或无菌水（避免残留氯影响）。
     • 清洗时间、温度、酶液浓度等参数严格遵循流程规定。
   • 漂洗： 清洗后，使用足量纯化水或无菌水对载体进行彻底漂洗，去除残留清洗剂。
   • 高水平消毒： 将清洗漂洗后的载体完全浸没于待测的高水平消毒剂溶液中。
     • 严格参数控制： 消毒剂浓度（需在试验开始时验证并记录）、温度、浸泡时间必须严格控制在产品说明书或验证流程规定的范围内（例如，邻苯二甲醛浓度为0.5-0.6%，浸泡时间≥5分钟，温度20-25℃）。
     • 确保接触： 需确保消毒液完全覆盖载体表面，管状载体需充满管腔并排出气泡。
   • 终末漂洗： 消毒处理后，使用足量、流动的无菌水或符合规范的终末漂洗水（如经除菌过滤的水），按照流程规定的时间和方式进行彻底漂洗，去除残留消毒剂。此步骤至关重要，防止残留消毒剂抑制后续微生物检测。

5. 微生物采样与检测：

   • 洗脱/中和：
     • 消毒并终末漂洗后的载体立即置于含有足量、经预先验证有效的中和剂的洗脱液（如D/E中和肉汤、含吐温80和卵磷脂的PBS等）中。
     • 洗脱方法应确保充分回收载体表面存活的微生物（如涡旋震荡、超声处理、反复抽吸灌注等）。洗脱时间应足够（通常≥10分钟）。
   • 中和剂验证： 必须提前进行中和剂鉴定试验，证明所选中和剂能有效中和残留消毒剂，且本身对微生物无毒害、无促进生长作用。
   • 活菌计数：
     • 将洗脱液进行系列十倍稀释（通常稀释至10⁻¹、10⁻²、10⁻³）。
     • 选择2-3个适宜稀释度，吸取一定量（如1.0 mL）接种至无菌平皿中，倾注营养琼脂（针对细菌）或特定分枝杆菌培养基（如Middlebrook 7H10/7H11琼脂）。
     • 同时设立阴性对照（仅中和剂洗脱液接种）以排除污染。
     • 细菌在适宜温度（如37℃）下培养24-72小时计数；龟分枝杆菌需在适宜温度（如30-37℃）下延长培养（通常≥7天）后计数。
   • 阳性对照计数： 对阳性对照载体进行相同的洗脱和活菌计数。
   • 阴性对照： 取无菌载体，经历除污染外的所有后续步骤（清洗、漂洗、消毒、终末漂洗、洗脱），进行微生物检测，结果应为阴性（<1 CFU/载体）。

6. 结果计算与判定：

   • 计算每个试验载体（消毒处理后）的平均菌落数（CFU/载体）。
   • 计算阳性对照载体的平均初始污染菌量（CFU/载体）。
   • 计算杀灭对数值（Log₁₀ Reduction）：
     杀灭对数值 (LR) = Log₁₀ (阳性对照平均菌量) - Log₁₀ (试验组平均菌量)
   • 合格判定： 按照规范要求，模拟现场试验需设置至少3个重复载体。所有重复载体的杀灭对数值均应≥3.00 lg（即99.9%的杀灭率），且阴性对照无菌生长，方可判定该消毒流程在本试验条件下合格。

三、 质量控制要点

1. 标准化操作： 所有步骤（菌株培养、载体处理、污染、清洗消毒操作、采样、培养计数）必须严格按照预先制定的标准操作程序执行。
2. 参数监控与记录： 消毒剂浓度、温度、关键步骤时间（清洗、消毒、漂洗）必须实时监测并详细记录。任何偏离方案的细节都应记录并评估其影响。
3. 中和剂有效性： 每次试验均应使用经鉴定有效的中和剂，并确保其在洗脱液中的浓度足以中和可能的最大残留消毒剂。
4. 避免交叉污染： 试验操作应在洁净环境（如生物安全柜）中进行，严格区分污染区、消毒处理区、无菌操作区。操作人员穿戴无菌手套、口罩、帽子。
5. 培养基质量控制： 所有培养基使用前需进行无菌检查和促生长试验。
6. 重复性与平行对照： 必须设置足够的重复样本（≥3个）和严格的阳性对照、阴性对照、中和剂对照（若需要）。
7. 干扰物质： 模拟预处理中使用含有机物的清洗液，符合临床污染含有机物的实际情况，增加试验挑战性。
8. 生物膜的挑战： 若进行生物膜模拟，需明确生物膜培养的时间和条件，并验证其形成情况（如通过扫描电镜观察），显著增加试验的严格性。

四、 意义与应用

内镜高水平消毒模拟现场试验是连接实验室基础杀菌试验与真实世界复杂情况的关键桥梁。其科学、严谨的开展，对于验证消毒流程的有效性、保障患者安全、预防内镜相关感染至关重要。该试验结果为新消毒方法的引入、现有流程的确认以及感染控制质量的持续改进提供了核心的科学数据和信心保障。医疗机构应定期或在消毒流程、设备、耗材发生重大变更时，依据相关标准规范执行可靠的模拟现场试验验证。

要点总结： 内镜消毒模拟现场试验通过选用代表性菌株、严格处理载体、模拟临床污染（尤其注重生物膜挑战）、严格执行消毒流程关键参数、有效中和残留及精准微生物检测，综合评估消毒效果是否达标。严谨的质量控制是试验结果可靠性的基石。