过氧乙酸低温等离子体灭菌效果测试

过氧乙酸低温等离子体灭菌效果测试：原理、方法与关键考量

摘要： 过氧乙酸低温等离子体灭菌技术结合了过氧乙酸的强氧化性与等离子体的高活性物质作用，为热敏性医疗器械提供了高效、低温的灭菌解决方案。本文系统阐述了该技术的灭菌原理、标准化测试方法、效果评价体系及关键影响因素，为灭菌效果的验证与质量控制提供参考依据。

一、 技术原理概述

过氧乙酸低温等离子体灭菌是一种物理化学协同作用的低温灭菌过程：

1. 过氧乙酸作用阶段： 灭菌循环启动后，液态过氧乙酸溶液被汽化并注入灭菌舱内。过氧乙酸分子具有极强的氧化能力，能穿透微生物细胞膜，破坏其蛋白质结构、酶系统和细胞壁/膜，实现初步的杀灭和生物负载的显著降低。
2. 等离子体作用阶段： 在过氧乙酸作用后，系统在灭菌舱内施加高频电磁场（通常为射频或微波），使舱内残留的过氧乙酸蒸汽、水分和注入的辅助气体（如氩气、氧气等）电离，产生富含高活性物质的低温等离子体。这些活性物质包括：
   • 自由基： 如羟基自由基 (·OH)、氧自由基 (·O)、过氧自由基 (·OOH) 等，具有极强的氧化能力。
   • 紫外线： 等离子体产生过程中伴随的短波紫外辐射具有破坏微生物核酸的作用。
   • 活性原子与分子： 如激发态的氧原子、臭氧等。
3. 协同灭菌机制： 过氧乙酸的初步氧化作用破坏了微生物的保护层，使其更易受到后续等离子体中高活性物质的攻击。等离子体中的自由基、紫外线和活性粒子能进一步彻底破坏微生物的 DNA/RNA、蛋白质和脂质等生命大分子，最终实现高度的灭菌保证水平（SAL ≤ 10⁻⁶）。整个过程中，灭菌腔体温度通常严格控制在 45°C - 60°C 之间，确保对热敏器械的安全。

二、 灭菌效果标准化测试方法

验证过氧乙酸低温等离子体灭菌效果需遵循严格的标准和科学的测试方法，核心包括：

1. 测试微生物的选择：

   • 指示微生物： 必须使用国际公认的、对灭菌过程具有强抵抗力的标准菌株。最常用的是：
     • 嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢 (Geobacillus stearothermophilus)：如 ATCC 7953 或其等效菌株。这是过氧乙酸低温等离子体灭菌过程最广泛认可的生物指示剂，其对过氧乙酸和等离子体的综合抵抗力强，用于证明 SAL 10⁻⁶ 的达成。
   • 其他挑战微生物（可选）： 根据特定需求或标准要求，可能还会测试对枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢 (Bacillus atrophaeus) 或其他特定病原体（如真菌、病毒）的杀灭效果，以评估灭菌谱的广度。

2. 生物指示剂 (BI) 的使用：

   • 载体： 芽孢被定量接种在非吸水性、化学惰性的载体上（如不锈钢片、玻璃片、特殊塑料片或滤纸条），形成标准化的生物指示剂条或片。
   • 接种量： 每片生物指示剂的芽孢数量通常在 10⁵ 到 10⁶ CFU（菌落形成单位），以保证在灭菌后能有效检测出存活芽孢（若有）。
   • 放置位置： 按照相关标准（如 ISO 11135, ISO 11137, AAMI TIR12, AAMI ST58）要求，将生物指示剂放置在灭菌舱内最难灭菌的位置（如管腔器械内部、器械关节处、包装材料内部、舱体角落、靠近进气口/排气口处）。每次测试需放置足够数量的 BI 以覆盖所有挑战点。

3. 过程挑战装置 (PCD)：

   • 为模拟实际器械（尤其是有细长管腔或复杂结构的器械）内部最难灭菌的条件，需使用标准化的过程挑战装置。这些 PCD 通常设计有狭窄管腔、盲端或特定材料组合，内部放置生物指示剂。使用 PCD 能更严格地评估灭菌过程对最难穿透部位的灭菌效果。

4. 灭菌循环运行：

   • 将负载（可以是模拟负载、PCD 或实际器械）和生物指示剂放入灭菌舱。
   • 严格按照设备制造商提供的、经过验证的灭菌循环参数运行整个灭菌程序。关键参数包括：
     • 过氧乙酸注入浓度/量
     • 各阶段（抽真空、过氧乙酸注入与扩散、等离子体激发、通风等）的时间与压力
     • 等离子体激发功率与时间
     • 总循环时间
     • 温度（需全程监控确保低温范围）

5. 生物指示剂培养与结果判读：

   • 灭菌循环结束后，立即取出生物指示剂。
   • 严格按照生物指示剂制造商提供的说明书进行培养：
     • 嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢：通常在 55°C - 60°C 下培养。
     • 培养时间通常为 24 - 48 小时，部分标准要求培养 7 天以检测极少数延迟生长的芽孢。
   • 阳性对照： 同时培养未经灭菌处理的同批次生物指示剂，应显示微生物生长（培养液变色或采用其他方法检测有活菌），证明 BI 本身是有效的。
   • 阴性对照： 使用未接种的培养基或灭菌过的载体培养，应无生长，证明培养基无菌。
   • 结果判定： 培养结束后，观察灭菌处理后的生物指示剂培养管/瓶。若所有灭菌处理后的 BI 均无微生物生长（培养液不变色/无活菌检出），而阳性对照有生长，则表明该次灭菌循环在测试条件下达到了无菌要求（通常指 SAL ≤ 10⁻⁶）。若有任何一个灭菌后的 BI 显示生长，则表明该次灭菌循环失败。

6. 重复测试与半周期法：

   • 为了正式验证灭菌程序的有效性，通常需要进行多次重复测试（如 3 次）以确认结果的可靠性和一致性。
   • 半周期法： 是确定最短有效灭菌时间或最低有效剂量的常用方法。通过运行一系列逐渐缩短时间或降低关键参数（如过氧乙酸浓度、等离子体作用时间）的“半周期”循环，找到刚好能使所有生物指示剂被杀灭的最短时间/最低剂量。将该时间/剂量加倍即可获得具有充分安全边界的全灭菌周期参数。

三、 灭菌效果的关键评价指标

1. 杀灭对数值 (Log Reduction)： 指灭菌过程使微生物数量减少的数量级。例如，若初始生物负载为 10⁶ CFU，灭菌后存活数为 1 CFU，则杀灭对数值为 6 Log。对于 SAL 10⁻⁶ 的灭菌保证水平，通常要求至少达到 6 Log 的杀灭对数值（当 BI 接种量为 10⁶ CFU 时）。
2. 灭菌保证水平 (Sterility Assurance Level, SAL)： 指一件物品在灭菌后仍存在活微生物的概率。国际标准（如 ISO 11135, ISO 17665）要求医疗器材灭菌的 SAL 必须 ≤ 10⁻⁶，即一百万件物品中理论上最多允许有一件存在活微生物。这是医疗器械灭菌的终极安全目标。
3. D 值 (D-value)： 指在特定灭菌条件下，杀灭 90% (1 Log) 测试微生物所需的时间（或剂量）。D 值越小，表明微生物对该灭菌过程的抵抗力越弱，灭菌效率越高。测定 D 值有助于深入了解灭菌动力学。

四、 影响灭菌效果的关键因素

1. 灭菌剂参数： 过氧乙酸的浓度、纯度、注入量及汽化效果直接影响其初始杀灭能力。
2. 等离子体参数： 激发源的功率、频率、作用时间、气体成分（如氩气、氧气比例）和流量决定了等离子体的密度、活性物质种类和浓度。
3. 灭菌腔体条件： 真空度、温度均匀性、湿度控制对过氧乙酸扩散、反应活性及等离子体生成至关重要。
4. 器械特性与装载：
   • 材质兼容性： 器械材质必须耐受过氧乙酸氧化和等离子体作用，且不产生抑制灭菌效果的残留物或吸收灭菌剂。
   • 结构复杂性： 管腔的长度、直径、盲端、关节缝隙等会增加灭菌剂和等离子体渗透的难度。
   • 清洁度： 器械上残留的有机物（血液、组织、蛋白质）或无机盐会严重屏蔽微生物，阻碍灭菌剂接触，是导致灭菌失败的最常见原因之一。彻底的清洗是灭菌成功的前提。
   • 包装材料： 包装材料（如特卫强 Tyvek® 纸塑袋、医用无纺布）必须允许灭菌剂（汽态过氧乙酸）和等离子体有效穿透，同时保持无菌屏障。包装方式（如封口完整性、松紧度）也会影响穿透性。
   • 装载方式： 器械在灭菌舱内的摆放应确保灭菌剂和等离子体在腔体内能自由流通，避免器械紧密叠放阻塞通道，尤其要保证最难灭菌部位（如管腔内）不被遮挡。应遵循设备制造商提供的装载指南。
5. 生物负载水平与抗力： 器械初始污染的微生物数量（生物负载）和种类（特别是芽孢的数量和抗力）会影响灭菌的难度。清洗和灭菌前的处理对控制生物负载至关重要。

五、 结论

过氧乙酸低温等离子体灭菌技术为热敏性医疗器械提供了一种高效、低温、干燥的灭菌选择。其效果验证依赖于严格的标准化测试流程，核心是使用高抗力的标准生物指示剂（嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢）和过程挑战装置（PCD），在预设的灭菌参数下运行，并通过规范的培养来判定是否达到 SAL ≤ 10⁻⁶ 的无菌保证要求。

成功的灭菌效果不仅取决于设备本身的性能和验证通过的灭菌程序参数，更受到器械清洁度、包装材料、装载方式以及日常设备维护和监测（如使用化学指示物、定期进行生物监测）的显著影响。因此，建立并执行完善的灭菌质量管理体系，涵盖从器械回收到灭菌后存储的全过程控制，是确保持续提供安全有效无菌医疗器械的根本保障。

持续验证、严格监控、规范操作是保障过氧乙酸低温等离子体灭菌效果，最终确保患者安全的基石。