空气消毒剂中和剂鉴定试验：方法与意义
空气消毒剂的效力评价是保障公共卫生安全的重要环节。在进行空气消毒剂的杀菌效果或病毒灭活效果试验时，消毒剂在作用后可能残留于采样介质或实验体系中，若未被有效中和，其持续的杀灭作用将严重干扰对微生物存活情况的准确判定，导致结果失真（常表现为假阴性）。因此，中和剂鉴定试验是评价空气消毒剂效果前不可或缺的关键步骤，旨在验证所选用的中和剂及其使用条件能有效、及时地消除残留消毒剂的活性，且对微生物生长或检测方法本身无显著干扰。
一、 试验目的
- 确认有效性： 验证所选择的中和剂（或中和剂组合）在规定的作用时间内，能否完全中和特定浓度空气消毒剂的残留活性。
- 确认无毒性： 验证中和剂本身及其与消毒剂反应后的产物，在规定浓度下对试验微生物的生长或检测无抑制或促进作用。
- 确认兼容性： 验证中和剂与微生物培养体系（如培养基）或后续检测方法兼容，不会干扰微生物的复苏、生长及计数。
- 确定适用性： 为后续正式的空气消毒剂杀菌/灭活效果试验提供可靠的中和终止方法依据。
二、 试验原理
中和剂鉴定试验的核心在于设置合理的对照组，通过比较不同组间微生物的存活或生长情况，来综合判断中和剂的效果和毒性。试验通常采用悬液定量法，在无菌试管中进行。
三、 试验材料
- 试验微生物：
- 推荐菌种： 通常选择抵抗力较强的标准菌株，如：
- 细菌繁殖体：金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、铜绿假单胞菌 (ATCC 15442)
- 真菌孢子：白色念珠菌 (ATCC 10231) - 当评价对真菌有效的消毒剂时
- 注意： 最终应使用与正式效果试验相同的微生物。
- 菌悬液制备： 取新鲜培养物制备成一定浓度的菌悬液（通常约 1×10⁸ CFU/mL），用磷酸盐缓冲液 (PBS) 或适宜稀释液稀释至试验所需浓度（通常约 1×10⁶ - 1×10⁷ CFU/mL）。
- 推荐菌种： 通常选择抵抗力较强的标准菌株，如：
- 消毒剂： 待测的空气消毒剂原液或使用液（浓度应不低于正式试验中使用的最高浓度）。
- 中和剂： 待鉴定的中和剂溶液或其组合（如硫代硫酸钠中和含氯消毒剂，卵磷脂-吐温80中和季铵盐类、醇类、酚类等）。
- 稀释液： 无菌 PBS 或其他适宜的不含中和成分的稀释液。
- 培养基： 适宜试验微生物生长的琼脂培养基（如胰蛋白胨大豆琼脂培养基 TSA 用于细菌）。
- 其他： 无菌吸管、无菌试管、恒温水浴箱、混匀器、计时器、菌落计数器等。
四、 试验分组与操作步骤
试验需设置以下 6 组（每组至少 3 个平行样本）：
- 阳性对照组 (1)：
- 操作： 0.1 mL 菌悬液 + 0.9 mL 稀释液 → 混匀 → 作用一定时间（通常 10 min）→ 取 1.0 mL 加入 9.0 mL 稀释液中 → 混匀 → 做 10 倍系列稀释 → 取适宜稀释度接种平板 → 培养计数。
- 目的： 验证菌悬液的初始活菌浓度及稀释、培养方法的可靠性。该组菌落数应最多。
- 中和剂对照组 (2)：
- 操作： 0.1 mL 菌悬液 + 0.9 mL 中和剂溶液 → 混匀 → 作用时间同(3)、(4)、(5)、(6)组 → 取 1.0 mL 加入 9.0 mL 稀释液中 → 混匀 → 做 10 倍系列稀释 → 取适宜稀释度接种平板 → 培养计数。
- 目的： 验证中和剂本身对微生物是否有毒性或促生长作用。菌落数应与阳性对照组 (1) 接近（通常要求差异在 15% 以内）。
- 中和产物对照组 (3)：
- 操作： 0.1 mL 菌悬液 + 0.9 mL 消毒剂与中和剂的混合物（预先将消毒剂与中和剂按正式试验比例混合，作用 10 min 以上）→ 混匀 → 作用时间同(2)组 → 取 1.0 mL 加入 9.0 mL 稀释液中 → 混匀 → 做 10 倍系列稀释 → 取适宜稀释度接种平板 → 培养计数。
- 目的： 验证消毒剂被中和后形成的产物混合物对微生物是否有毒性或促生长作用。菌落数应与阳性对照组 (1) 接近（通常要求差异在 15% 以内）。
- 消毒剂残留影响组 (4)：
- 操作： 0.1 mL 菌悬液 + 0.9 mL 消毒剂溶液 → 混匀 → 作用预定时间（即正式试验中消毒剂与微生物接触的时间）→ 取 1.0 mL 加入 9.0 mL 稀释液中（不含中和剂！）→ 混匀 → 作用时间同(2)、(3)组（模拟中和等待时间）→ 做 10 倍系列稀释 → 取适宜稀释度接种平板 → 培养计数。
- 目的： 验证若不使用中和剂，仅靠稀释是否能有效去除消毒剂残留活性。该组菌落数应显著低于阳性对照组 (1)，甚至为 0，证明消毒剂残留活性未被去除。
- 中和剂+消毒剂组 (5)：
- 操作： 0.1 mL 菌悬液 + 0.9 mL 消毒剂溶液 → 混匀 → 作用预定时间（同(4)组）→ 取 1.0 mL 加入 9.0 mL 中和剂溶液中 → 混匀 → 作用时间同(2)、(3)组 → 取 1.0 mL 加入 9.0 mL 稀释液中 → 混匀 → 做 10 倍系列稀释 → 取适宜稀释度接种平板 → 培养计数。
- 目的： 这是最关键的一组，模拟正式试验中消毒剂作用后被中和的过程。验证中和剂能否有效终止消毒作用并允许微生物复苏生长。
- 稀释液对照组 (6)：
- 操作： 0.1 mL 稀释液 + 0.9 mL 稀释液 → 混匀 → 作用时间同(1)-(5)组 → 取 1.0 mL 加入 9.0 mL 稀释液中 → 混匀 → 作用时间同(2)-(5)组 → 做 10 倍系列稀释 → 取最高稀释度或原液接种平板 → 培养计数。
- 目的： 验证稀释液及操作过程中是否无菌。该组应无菌生长。
五、 培养与计数
- 将接种好的平板置于适宜温度（细菌通常 35-37°C，真菌 25-28°C）下培养规定时间（细菌通常 24-48 小时，真菌 48-72 小时）。
- 进行菌落计数。
六、 结果判定
试验需重复 3 次。符合以下全部条件，可判定该中和剂及其使用方案适用于该空气消毒剂的效果评价：
- 阴性对照符合要求： 稀释液对照组 (6) 应无菌生长。
- 中和剂及中和产物无毒：
- 中和剂对照组 (2) 的平均菌落数 (CFU/mL) 与阳性对照组 (1) 的平均菌落数 (CFU/mL) 相比，差异率应在 ±15% 以内。
- 中和产物对照组 (3) 的平均菌落数 (CFU/mL) 与阳性对照组 (1) 的平均菌落数 (CFU/mL) 相比，差异率应在 ±15% 以内。
- 残留消毒剂影响显著： 消毒剂残留影响组 (4) 的平均菌落数 (CFU/mL) 应远低于阳性对照组 (1)，通常应少于阳性对照的 1% 或甚至为 0，证明残留活性未被有效去除。
- 中和剂有效： 中和剂+消毒剂组 (5) 的平均菌落数 (CFU/mL) 与阳性对照组 (1) 的平均菌落数 (CFU/mL) 相比，差异率应在 ±15% 以内。这表明中和剂成功消除了消毒剂的残留活性，使微生物得以存活并被检出。
七、 注意事项
- 浓度选择： 消毒剂浓度应不低于正式试验最高浓度；中和剂浓度需足够中和该浓度消毒剂。
- 作用时间： 消毒剂与微生物的作用时间、中和剂与消毒剂-微生物混合物的作用时间（即中和时间）需明确规定并与后续正式试验一致。
- 温度控制： 整个试验过程应在恒温（如 20±1°C）水浴中进行，以控制反应速度。
- 混合充分： 各步骤加入液体后需立即充分混匀。
- 稀释准确： 稀释操作需准确、迅速，避免时间误差。
- 菌液活性： 确保试验菌悬液新鲜且活性良好。
- 平行试验： 每次试验必须设置足够的平行样本（≥3），计算平均值。
八、 结论
中和剂鉴定试验是科学评价空气消毒剂效果的前提和基石。只有通过严谨的鉴定，确认所选用的中和剂能有效、无毒地终止残留消毒剂的活性，才能保证后续杀菌或灭活效果试验结果的准确性和可靠性。该试验应遵循标准化操作程序，严格设置对照组，控制试验条件，并根据判定标准得出明确结论。选择合适的、经过鉴定的中和剂，是获得可信的空气消毒剂效能数据的关键环节。