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手足口病毒灭活效力的定量检测方法
一、试验原理
本试验依据悬液定量杀灭法，通过计算试验组与载体对照组病毒滴度的对数值差值（即灭活对数值），客观评价消毒因子对肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）的灭活效果。手足口病毒属于小RNA病毒科，对理化因子敏感度存在显著差异，需通过标准化试验验证灭活效能。
二、病毒株与细胞系
- 指示病毒
- 肠道病毒71型（EV71 BrCr株，ATCC VR-784）
- 柯萨奇病毒A16型（CA16 G-10株，ATCC VR-1826）
- 宿主系统
非洲绿猴肾细胞（Vero细胞，ATCC CCL-81）培养于含2%胎牛血清的MEM培养基
三、试验关键步骤
（一）病毒悬液制备
- 感染Vero细胞至90%病变，冻融3次后离心取上清
- 添加终浓度30%甘油，分装保存于-80℃
- 使用前经0.22μm滤膜除菌，TCID50测定滴度≥10⁷/0.1mL
（二）载体加载
- 无菌载体（不锈钢片/乳胶片）预处理：121℃灭菌15min
- 每载体加载10μL病毒悬液，生物安全柜内干燥（30±2℃, RH45±5%）
（三）中和剂鉴定
采用三联中和法验证（表1）：
| 组别 | 处理方式 | 合格标准 |
|---|---|---|
| 中和剂组 | 中和剂+病毒 | 残存病毒≤0.5 lg |
| 中和产物组 | 供试品+中和剂+病毒 | 与病毒组差值≤0.5 lg |
| 病毒对照组 | 单纯病毒 | 滴度≥10⁶ TCID50 |
（四）试验流程
图表
代码
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graph LR A[制备病毒载体] --> B[供试品作用] B -->|作用时间点| C{立即中和} C --> D[10倍梯度稀释] D --> E[接种Vero细胞] E --> F[37℃培养7天] F --> G[TCID50终点法计算]四、试验有效性判定
- 阳性对照组平均病毒滴度 ≥10⁶ TCID50/mL
- 温度对照组与阳性对照组滴度差 ≤0.5 lg
- 中和剂系统符合三联鉴定要求
- 所有平行试验标准差 ≤0.3 lg
五、结果计算
灭活对数值（KL）= lgN₀ - lgNₓ
其中：
N₀：载体对照组平均病毒滴度（TCID50/mL）
Nₓ：试验组平均病毒滴度（TCID50/mL）
六、结论判定标准
- 有效灭活：各时间点KL值 ≥4.00（对应99.99%灭活率）
- 临界值：单次试验KL值≥3.00，且三次试验均值≥3.50
七、方法学验证要点
- 病毒回收率：载体洗脱回收率应≥20%
- 温度补偿：试验环境波动超过±2℃时需设置温度补偿组
- 有机干扰：含3.0g/L牛血清白蛋白模拟有机物存在条件
八、注意事项
- 病毒培养需在BSL-2实验室进行，废弃物121℃高压灭菌30min
- 试验需设置胰酶处理组（终浓度50μg/mL）维持病毒感染力
- 采用实时荧光定量PCR法辅助验证病毒载量时，需建立TCID50与Ct值的标准曲线
本方法依据《消毒技术规范》（2019版）及ISO 18184:2019标准制定，适用于各类物理/化学消毒因子的手足口病毒灭活效能评估。试验参数可根据具体研究对象调整，但核心质量控制点需严格遵守。